包涵体复性过程中,用盐酸胍和尿素哪个好,有什么区别?

摘 要:

在包涵体的变性溶解及复性过程使用的盐酸胍和尿素的优缺点分别为:尿素溶解包涵体的能力相对较弱,但具有不电离、呈中性、成本低、蛋白质复性后不会造成大量蛋白质沉淀等优点;盐酸胍溶解包涵体的能力相对较强,不会造成重组蛋白质的共价修饰。但有成本高、在酸性条件下易产生沉淀、对蛋白质离子交换色谱有干扰等缺点。

关键词: ,

做蛋白的人几乎都会涉及到包涵体的变性溶解与复性。在包涵体的变性溶解及复性过程中最常用的试剂是盐酸胍和尿素,那么这两种试剂有什么区别呢?

1、溶解包涵体的能力不同。尿素和盐酸胍属中强度变性剂,它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用,但尿素溶解包涵体的能力较盐酸胍慢而弱。所需浓度尿素常为8M,8M尿素对大约三分之一种类的蛋白包涵体溶解效果较差,溶解能力为70-90%;盐酸胍常为6M,6M盐酸胍+DTT能溶绝大多数包涵体,溶解能力达95%以上。在室温下4~6mol/L尿素或3~4mol/L盐酸胍,可使球状蛋白质从天然状态转变为变性状态的中点。增加变性剂浓度可提高变性程度,通常8mol/L尿素或约6mol/L盐酸胍可以使蛋白质完全转变为变性状态。盐酸胍由于具有离子特性,因而比尿素的变性能力强。有一些蛋白质,在8mol/L尿素溶液中也不能完全变性,但是在8mol/L盐酸胍溶液中,它们一般以无规卷曲(完全变性)构象状态存在。

2、尿素可能会对蛋白质的氨基进行共价修饰,使一些氨基酸残基酰基化。8M尿素溶解的包涵体溶液在低温,如4℃可以较长期放置,甚至放置半个月也不会有太大影响。但在室温放置超过24小时,就可能会对目的蛋白有影响,因为尿素在作用时间较长或温度较高时会裂解形成氰酸盐,对重组蛋白质的氨基进行共价修饰,使一些氨基酸残基酰基化,从而可能会影响到复性蛋白质的生物学活性。

3、尿素或盐酸胍溶液溶解包涵体的机制:蛋白质在高浓度(4~8mol/L) 的尿素或盐酸胍水溶液中时,氢键断裂,从而使蛋白质发生不同程度的变性。同时,还可通过增大疏水氨基酸残基在水相中的溶解度,降低疏水相互作用。尿素和盐酸胍引起的变性包括两种机制:第一种机制是变性蛋白质能与尿素和盐酸胍优先结合,形成变性蛋白质-变性剂复合物。随着变性剂浓度的增加,天然状态的蛋白质不断转变为复合物,最终导致蛋白质完全变性。然而,由于变性剂与变性蛋白的结合是非常弱的,因此,只有高浓度的变性剂才能引起蛋白质完全变性;第二种机制是尿素与盐酸胍对疏水氨基酸残基的增溶作用。因为尿素和盐酸胍具有形成氢键的能力,当它们在高浓度时,可以破坏水的氢键结构,结果尿素和盐酸胍就成为非极性残基的较好溶剂,使蛋白质分子内部的疏水残基伸展和溶解性增加。

4、各自优缺点:尿素溶解包涵体的能力相对较弱,但用尿素溶解具有不电离、呈中性、成本低、蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀以及溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化等优点;盐酸胍溶解包涵体的能力相对较强,溶解作用快,且不会造成重组蛋白质的共价修饰。但它也有成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后可能造成大量蛋白质沉淀和对蛋白质离子交换色谱有干扰等缺点。

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