细胞培养中支原体污染的检测方法

摘 要:

细胞培养中最令人头疼的问题之一是支原体的污染。据统计细胞培养中支原体感染发生率达到63%,对实验结果会产生不可预期的影响。而支原体污染的症状不如细菌、真菌、霉菌污染比较容易辨认,一般需要采用其它方法进行检测,常用的方法包括直接观察法、分离培养法、荧光染色法(DNA染色法)、PCR检测法、电镜法、免疫荧光法等。

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细胞培养中最令人头疼的问题之一是支原体的污染。在人们日常生活工作环境中,支原体无处不在,它可以通过人的毛发、口腔、穿着的衣服、动物的皮毛以及日常的细胞培养的操作环境造成对细胞污染。

据说有11%的细胞株均受到不同程度的支原体污染,更有统计细胞培养中支原体感染发生率达到63%,对实验结果会产生不可预期的影响。而支原体污染的症状不如细菌、真菌、霉菌污染比较容易辨认,一般需要借助其他手段,如PCR、荧光染色试剂盒、培养菌落等方法。

造成细胞污染的支原体有很多,但主要有四种支原体:口腔支原体、精氨酸支原体、猪鼻支原体和莱氏无胆甾原体。由于支原体体积很小,直径约在0.2-2.0um之间,可以通过滤膜而直接造成培养基或血清的污染。另外,被支原体污染的细胞培养基液体往往并不浑浊,细胞受损程度并不明显,形态很少改变,这样就更增加 了人们对其的防范难度。

从形态结构上,支原体形态多变,它多吸附在细胞表面或散于细胞与细胞之间。从其理化或生物学特性上讲,所有支原体代谢均需胆固醇,部分需要精氨酸和葡萄糖。支原体的生存要求比细菌高,同时,除需基本营养物质外,还需10-20%血清,最适pH值在7.8-8.0之间,多数支原体呈兼性厌氧,其繁殖方式主要是二分裂繁殖,分裂和其DNA复制不同步,可形成多核长丝体。

由于支原体是一类缺乏细胞壁的微生物,因此它对作用于细胞壁类的抗生素(如青霉素G)不敏感。支原体对热的抵抗力和细菌相似,而对环境渗透压的变化比较敏感。支原体对细胞的影响,可以从两方面考虑。一方面是对细胞的直接影响,细胞被支原体污染后,增殖缓慢,部分细胞变圆,从瓶壁上脱落,部分细胞虽然表面变化不十分明显,实际上潜伏着多方面的危险。另一方面,支原体可以通过消耗培养基中的精氨酸,抑制细胞DNA、RNA的合成,降低细胞的抵抗力。因此,支原体污染对细胞的影响是非常广泛和深远的。

由于支原体种类不同,应采取不同的方法进行检测,常用的方法有如下几种:

1、观察细胞的形态和生长特征:支原体污染比较严重时可出现生长减慢,有的培养基pH明显变酸,并出现细胞病变,其病变特征与病毒感染相似,因此不能准确诊断。

2、分离培养法:大多数支原体可出现特有的典型菌落。该方法准确、可靠,但时间长。 但其实验周期较长,所以常用于进行对怀疑细胞的最后甄别。

3荧光染色法(DNA染色法):此法快捷、简便、价廉,但其灵敏度有一定欠缺,易造成漏检,若细胞片制备不当则结果难以判断。

4、PCR法检测支原体:最为快速、灵敏,取样量少,既可进行细胞检测也可进行细胞上清的检测,同时可以检测8种支原体的污染,是目前常用的检测手段。但其成本较高,条件要求严格,有时易出现假阳性。

5、电子显微镜和免疫电子显微镜法:此法非常直观、准确,但对使用环境要求高,操作复杂,实验周期较长,敏感性不高,常作为样品的最后定性检测。

6、间接免疫荧光法和免疫印迹:简便、快速、特异性强,如果应用单克隆抗体试剂,效果会更好。

7、其他方法 :放射性核素掺入法、放射自显影法、基因探针法等。

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  1. avatar 烘干机

    好久没来了,过来看看支持下!!!!!!

  2. avatar 有机肥料烘干机

    打酱油一定得选最好的酱油瓶子

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