大提质粒的试剂配制和操作方法

摘 要:

现在市面上有各种各样的质粒提取试剂盒,如大提质粒、小提质粒、革兰氏阴性菌、阳性菌,还有一些针对特定质粒的提取试剂盒,因此自己配制试剂的时间很少了,尤其是大提质粒非常少。但在提一些特殊的质粒,或是做文库的时候,还需要大提质粒,因此了解一下大提质粒的试剂配制和操作步骤也是有必要的。

关键词:

提取质粒是分子生物学最基本的实验操作技术,在刚上研究生的时候,由于导师在国外,我只能跟着别人做实验。那时候科研经费少、试剂盒贵,都是自己配制试剂提质粒,开始的半年时间基本上全用在提质粒上了。现在市面上有各种各样的质粒提取试剂盒,如大提质粒、小提质粒、革兰氏阴性菌、阳性菌,还有一些针对特定质粒的提取试剂盒,因此自己配制试剂的时间很少了,尤其是大提质粒也非常少了。但在提一些特殊的质粒,或是做文库的时候,还需要大提质粒,因此了解一下大提质粒的试剂配制和操作步骤也是有必要的。

一、试剂配制(小量)

1.  1M(M代表摩尔浓度即mol∕L)NaOH (400ml ):分子量为40,秤取16g NaOH, 溶于400ml DDW中。

2.  2M Tris-HCl (500ml): 分子量为121.14, 秤取121.14g Tris,放入干净的500ml烧杯中,加400 ml DDW,置于搅拌器上搅拌溶解,用HCl调节pH值为8.0(首先直接加12M的浓盐酸约20ml,接近8.0时再用1M HCl 调节), 定容至500ml,4℃保存。

3.  10%SDS (200ml): 称量20gSDS,放入干净的烧杯中,加100 ml DDW,定容到200ml,室温保存。(SDS具有较强的刺激性,称量时一定带好口罩,动作轻柔)。

4.  Buffer P1 (500ml): 用50ml离心管量取10ml 0.5M的EDTA,然后量取12.5ml 2M 的Tris-HCl,放入干净的烧杯中,加入300ml DDW,置于搅拌器上搅拌溶解,用HCl调节pH值为8.0(大约加12M的浓盐酸1ml ),定容至500ml,4℃保存。

5. Buffer P2(100ml): 20ml 1M NaOH和10ml 10%SDS放入200ml的玻璃瓶中,然后加入70ml DDW,混匀,室温放置过夜,使其自溶,最后室温保存。(注:不需要定容,严格按步骤操作)。

6.  Buffer P3 (500ml) : 秤取147.21g乙酸钾,溶于300ml DDW中,置于搅拌器上搅拌溶解,用冰醋酸调节pH值为5.5,(约加80–100ml冰醋酸), 定容至500ml,4℃保存。

7.  Buffer QBT(500ml):分别称取NaCl 21.915g, MoPS 5.23g, 放于干净的500ml烧杯中,加入300ml DDW,置于搅拌器上搅拌溶解,用1M NaOH调节pH值为7.0(约加10–15ml NaOH),然后加入75ml 异丙醇,定容至500ml,4℃保存。

8.  Buffer QC(500ml):分别称取NaCl 29.22g, MoPS 5.23g,放于干净的500ml烧杯中,加入300ml DDW,置于搅拌器上搅拌溶解,用1M NaOH调节pH值为7.0(约加9ml NaOH,然后加入75ml 异丙醇,定容至500ml,4℃保存。

9.  Buffer QF(500ml):称取NaCl 36.525g, 量取2M Tris-HCl 12.5ml,放于干净的500ml烧杯中,加入300ml DDW,置于搅拌器上搅拌溶解,用1M NaOH调节pH值为8.5 (约加0.1ml NaOH),然后加入75ml异丙醇,定容至500ml ,4℃保存。

10.  配制RNase:

(1) 将RNase粉末溶于10mM的乙酸钾(即Buffer P3),配制成浓度为10mg/ml的溶液。

(2) 将配好的RNase溶液100℃加热10min, 随后冷却至室温。

(3) 用1M 的Tris-HCl调节pH值至7.4,大约需要0.1体积的Tris-HCl。

(4) 分装RNase溶液于1.5ml EP管中,-20℃保存。

二、试剂配制(大量)

1.  1M NaOH (400ml ): 分子量为40,秤取16g NaOH, 溶于400ml DDW中。

2.  2M Tris-HCl (500ml): 分子量为121.14, 秤取121.14g Tris,溶于400 ml DDW中,用HCl调节pH值为8.0, 定容至500ml。

3.  Buffer P2(1000ml):  称取10g SDS, 放入1000ml的玻璃瓶中,然后加入750ml DDW,最后加入200 ml 1M的NaOH,混匀,室温放置过夜,使其自溶。(注:不需要定容,严格按步骤操作。)

4.  Buffer P1 (1000ml): 用50ml离心管量取20ml 0.5M的EDTA,然后量取25ml 2M 的Tris-HCl,加入700ml DDW, 用HCl调节pH值为8.0,定容至1000ml。

5.  Buffer P3 (1000ml) : 秤取294.42g乙酸钾,溶于800ml DDW中,用冰醋酸调节pH值为5.5,定容至1000ml。

6.  Buffer QBT(1000ml):分别称取NaCl 43.83g, MoPS 10.46g, 加入600ml DDW, 用NaOH调节pH值为7.0,然后加入150ml 异丙醇,定容至1000ml。

7.  Buffer QC(1000ml):分别称取NaCl 58.44g, MoPS 10.46g, 加入600ml DDW, 用NaOH调节pH值为7.0,然后加入150ml 异丙醇,定容至1000ml。

8.  Buffer QF(1000ml):称取NaCl 73.05g, 量取2M Tris-HCl 25ml, 加入800ml DDW,用NaOH调节pH值为8.5,然后加入150ml 异丙醇,定容至1000ml。

9.  配制RNase:

(1) 将RNase粉末溶于10mM的乙酸钾(即Buffer P3),配制成浓度为10mg/ml的溶液。

(2) 将配好的RNase溶液100℃加热10min, 随后冷却至室温。

(3) 用1M 的Tris-HCl调节pH值至7.4,大约需要0.1体积的Tris-HCl。

(4) 分装RNase溶液于1.5ml EP管中,-20℃保存。

三、操作步骤

准备工作:

  • 大提质粒的前两天用50ml离心管摇菌,在5-7ml加有氨苄抗生素AMP的LB液体培养基中挑菌,37℃下摇菌12-16h。
  • 大提质粒前一天将50ml离心管摇好的菌液500ml大三角瓶中加入含有氨苄抗生素AMP的LB液体培养基200ml,37℃下摇菌12-16h。

1. 沉淀菌液:向离心机配套的50 ml离心管中,加入30 ml菌液,6000 g离心10min, 大约沉淀菌液200 ml。(注意:配平离心管,离心时要在离心管壁和盖上都做好标记,且离心时写字的管壁侧朝向外,以便容易找到沉淀物)。离好一管,取回弃去上液保留沉淀物,再反复离心直到所有200ml菌液全部离完),打开盖倒置吸水纸上控干。

2. 溶解沉淀: 量取10 ml Buffer P1, 加入100μl RNase A, 混匀后,加入到离心沉淀的菌中,用振荡器充分溶解菌液沉淀(可用15ml离心管量取, Buffer P1 加入沉淀离心管是管口不要接触,以防互相污染)。

3. 加入10 ml Buffer P2,液体呈现蓝色,轻轻混匀,使其充分反应,冰上放置2-3min即可。(此步主要是碱裂解细菌,使其中的蛋白质和DNA变性,反应时间不能太长,否则容易使大肠杆菌基因组DNA断裂成小片段,污染质粒DNA)

4. 加入10 ml 预冷的Buffer P3,轻轻颠倒混匀,直到蓝色全部消失,出现白色蛋白沉淀,冰上放置20min。(此步发生酸碱中和反应,pH值降低,使变性的DNA双链结构恢复,其中的SDS可以充分与蛋白质结合,使其析出)

5. 20 min后,6000 g 4℃离心25min。同时,向柱子中加入5ml Buffer QBT,使其全部流过柱子,平衡柱子。如果是重复使用的柱子,先使其中的HCl全部流尽,然后加满DDW清洗2遍柱子,最后再加入Buffer QBT平衡柱子。

6. 剪一小块纱布,折叠4层,放于柱子上部。将离心后的液体缓慢倒入纱布中,最后挤压纱布使其中的液体全部直接过滤到柱子中,使其充分流过柱子。(如果此步不只1个质粒时,挤压不同质粒的纱布时,一定要换手套,避免污染质粒)

7. 清洗柱子: 液体全部流过柱子后,向柱子中直接加满Buffer QC,使其全部流过柱子,清洗2遍,弃去废液。

8. 洗脱质粒: 向柱子中加15ml Buffer QF,靠重力作用使其全部通过柱子,收集洗脱液。(注:要收集到一个新的管中)

9. 沉淀质粒:向收集的液体中,加入0.7倍体积(即10.5 ml)异丙醇,轻轻混匀,6000 g 4℃离心25 min。(异丙醇可以充分沉淀质粒,但同时会沉淀很多盐分)

10. 清洗质粒:离心后,注意质粒贴壁的方向,应从其侧面倒掉废液。然后加入10 ml 70%的乙醇,轻轻晃动(不能用枪吹散,否则会损失很多质粒)。

11. 沉淀质粒:6000 g 4℃离心10min,轻轻吸弃废液,将质粒开盖晾置,使乙醇充分会发。(质粒中的乙醇会影响后续反应中的酶活性)

12. 溶解质粒:用300ulDDW或TE溶解步骤11中的质粒,转移到新的1.5mlEP管中,做好标记,检测浓度。

13. 柱子回收:

(1) 先用自来水冲洗柱子内外;

(2) 再用蒸馏水和DDW冲洗柱子内外,最后加满DDW,使其全部通过柱子,清洗2次。

(3) 向柱子中加满1 M HCl,柱子底部盖上盖子,顶部用封口膜封上,室温放置过夜。(HCl可充分降解DNA)

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