镍柱琼脂糖树脂(Ni-NTA resin)再生方法

摘 要:

镍柱纯化是为了纯化带有6个组氨酸(碱性氨基酸)标签的重组蛋白而设计,具有高度的亲和力和选择性。当Ni-NTA琼脂糖的颜色由浅蓝色变成灰褐色或白色时,需彻底再生后才能使用。再生方法总体可分为除去柱上残余蛋白、除镍、挂镍等三个步骤。先用变性剂和乙醇除去残余蛋白和脂类,再用EDTA与金属镍离子螯合去除镍,然后用NiSO4进行挂镍。

蛋白中的组氨酸残基可以和许多金属离子,例如锌、铜、镍、铁等形成复合物。因此,带有金属离子的柱料能选择性螯合具有组氨酸残基的蛋白质。半胱氨酸和络氨酸残基也能和固定化金属螯和,但是亲和力比组氨酸要弱。金属螯和柱料主要是由亚氨基的乙酰乙酸成分耦联琼脂糖柱料。

镍柱纯化是为了纯化带有6个组氨酸标签的重组蛋白而设计的,Ni柱中的硫酸镍(NiSO4)可以与碱性蛋白结合。镍柱纯化系统设计了镍柱琼脂糖对串联排列的6-His(碱性氨基酸)残基有高度的亲和力和选择性。用咪唑洗脱目的蛋白时,咪唑会竞争性结合Ni,目的蛋白被洗脱下来。

如果纯化同一种蛋白,Ni-NTA resin不需要再生,可以重复使用3-5次。通常在使用3-5次后,结合效率有所下降,需用0.5M NaOH洗涤,也可用6M盐酸胍加500mM咪唑洗5-6个柱体积,然后用结合缓冲液平衡后即可再使用。但是,当Ni-NTA琼脂糖的颜色由浅蓝色变成灰褐色或白色时,则镍离子已经从柱子中丢失,Ni-NTA树脂需彻底再生后才能使用。再生方法总体可分为除去柱上残余蛋白、除镍、挂镍等几个步骤,具体方法如下:

一、所需试剂:

再生缓冲液:6M盐酸胍+ 0.2M乙酸

2% SDS(m/V)

25%、30%、50%、75%、100%的乙醇(V/V)

100mM EDTA(pH8.0)溶液

100mM NiSO4溶液

二、镍柱(Ni-NTA)树脂再生步骤:

(1)从层析柱下端流干所有溶液,用2倍NTA树脂体积的再生缓冲液洗。

(2)用2倍体积的去离子水洗。

(3)用3倍体积的2% SDS洗。

(4)用1倍体积的25%乙醇洗。

(5)用1倍体积的50%乙醇洗。

(6)用1倍体积的75%乙醇洗。

(7)用5倍体积的100%乙醇洗。

(8)用1倍体积的75%乙醇洗。

(9)用1倍体积的50%乙醇洗。

(10)用1倍体积的25%乙醇洗。

(11)用1倍体积的去离子水洗。

(12)用5倍体积的100mM EDTA pH8.0 洗。

(13)用3倍体积的去离子水洗。

(14)用2倍柱体积的100mM NiSO4洗。

(15)用2倍柱体积的双蒸水洗。

(16)用2倍柱体积的再生缓冲液洗。

(17)2倍柱体积的缓冲液平衡Ni-NTA树脂

(18)将再生后的Ni-NTA树脂保存在20%的乙醇中

注:

其中乙醇洗涤的目的是由于其对脂蛋白、脂肪、疏水蛋白的去除效果较好,所以再生前需用不同浓度的乙醇洗柱。

EDTA可与金属镍离子螯合,从而去除镍,然后再用NiSO4进行挂镍。

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