痢疾志贺氏菌的分子生物学检测方法

志贺氏菌的感染剂量非常低,只要有10个以上的活菌即可能引起感染。同时它能够污染很多食物,包括蔬菜、奶、肉类、蛋制品和奶制品等,因此相对于其它病原菌,对于食物中志贺氏菌污染的检测显得更为重要。欧洲和北美的许多国家的法律规定,对于食物病原菌检测时,要对25g样品进行检测,其中不能检出志贺氏菌存在,因此在检测之前往往需要对25g食物样品先进行增菌培养。

志贺氏菌传统的检测方法是将食物匀浆涂在选择性培养基上进行培养,有时可能还需要先进行增菌培养。然后用血清学的方法进行检测和分型。这种方法即费时又费力,有时要得出检测结果可能需要花费几周时间,而食物在经过这么长时间的保存以后其质量会显著降低,因此对于志贺氏菌的检测方法亟待改进。

志贺氏菌的许多特征与肠杆菌科细菌大肠杆菌一致,它们之间有一些相同或相似的生物型或血清型,而且DNA杂交试验表明志贺氏菌和大肠杆菌K-12的基因组DNA有73%以上的同源性,因此志贺氏菌与大肠杆菌常常被归为一类,只是在临床或流行病学研究时才将之区分开来。

虽然对于痢疾志贺氏菌检测中血清学检验是重要的方法之一,但是由于志贺氏菌和大肠杆菌之间有这种亲缘关系,因此经常出现血清学交叉反应,在不同血清型痢疾志贺氏菌之间也可能有血清学交叉反应,而且目前对于有的血清型痢疾志贺氏菌还没有血清可用,因此用血清学方法进行检测具有一定的局限性。

由于志贺氏菌和肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)对肠上皮细胞都具有侵袭性,都可通过食物传播,Villalobo等针对其编码侵袭因子的基因virA设计引物进行PCR检测,该方法的敏感性和特异性都较好。

为了克服用血清学方法进行检测的缺点,近些年发展了一些分子生物学的方法作为补充。Matsushita等通过用MluI对痢疾志贺氏菌核糖体DNA进行限制性酶切分析的方法进行分型,现在已经建立了痢疾志贺氏菌的计算机辅助核糖体DNA分析数据库。由于痢疾志贺氏菌合成O抗原所需要的酶主要是由染色体上的rfb基因簇所编码,Coimbra等建立了一种方法,通过对扩增的rfb基因簇进行限制性酶切分析对痢疾志贺氏菌进行分型,这种方法又叫做rfb限制性片段长度多态性(rfb-RFLP)分析。

此外根据志贺氏菌的基因组特征,还发展出了一些快速、高灵敏和特异的检测方法,其中DNA探针杂交和PCR检测技术是发展得最快的两种方法。

Islam等通过对临床的粪便样品进行培养以后,用PCR的方法进行检测,他们针对志贺氏菌侵袭性大质粒上的ipaH基因设计了一对引物H8(5'-GTTCCTTGACCGCCTTTCCGATAC-3')和H15(5'-GCCGGTCAGCCACCCTA-3'),将PCR扩增产物再与特异性的ipaH探针进行杂交,以确定是那种类型的志贺氏菌。结果表明这种方法的敏感性达到72%,特异性达到100%,比传统的血清学方法的敏感性和特异性都高出许多,因此这种方法有可能作为临床诊断或流行病学调查的有效手段。他们还通过免疫磁性分离(Immunomagnetic separation,IMS)和PCR相结合的方法检测痢疾志贺氏菌和弗氏志贺氏菌,首先将弗氏志贺氏菌和痢疾志贺氏菌LPS中的一个共同的抗原表位的单抗包被在载体颗粒上,粪便中的志贺氏菌就能与包被有单抗的载体结合,再通过PCR和特异性探针的方法即可检测到粪便中的痢疾志贺氏菌和弗氏志贺氏菌。这种方法耗时短,2~3小时即可得到结果,其敏感性可达103CFU/ml。

Jackson通过用洋地黄毒甙配基(Digoxigenin)标记的dUTP进行PCR,将PCR产物与固定在硝酸纤维素膜上的特异序列进行杂交,然后再用结合有碱性磷酸酶的洋地黄毒甙配基抗体和显色底物进行反应,通过这种方法也能够检测到痢疾志贺氏菌。这种方法的优点是不需要纯化DNA样品,不进行凝胶电泳和放射性探针,它也是临床检测痢疾志贺氏菌的方法之一。此外还有人通过用PCR和荧光抗体染色的方法检测Ⅰ痢疾志贺氏菌,其敏感性为92%,特异性为93%。

由于Ⅰ型痢疾志贺氏菌能够产生志贺毒素,它能够引起感染者出现严重的继发症状,因此对于它的检测应特别注意。对于Ⅰ型痢疾志贺氏菌的检测主要集中在两个靶基因,一是侵袭性大质粒上的特异性毒力基因,另一个是针对志贺毒素及其编码基因,用这两个片段设计的特异性引物进行PCR即可检测出Ⅰ型痢疾志贺氏菌。

    日期:2014年02月19日  分类:病原菌
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