葡聚糖结合蛋白B(glucan binding protein B,GbpB)-壳聚糖纳米颗粒系统的构建及免疫

摘 要:

壳聚糖纳米颗粒能包被多种蛋白,经鼻和经口免疫动物,均取得好的效果。制备壳聚糖微颗粒-纳米颗粒方法有很多,卫克文等采用乳化-化学交联法,制备了葡聚糖结合蛋白B -壳聚糖纳米颗粒系统,并检测其经鼻免疫大鼠的效果。结果纳米颗粒大小为50-100 nm之间,免疫后与阳性对照组抗体滴度相当,但维持的抗体滴度更稳定和持久。

关键词: ,

壳聚糖是新开发的一种新型、有效、安全的非病毒黏膜载体,在流感、百日咳、白喉、破伤风类毒素疫苗等均取得好的结果。壳聚糖纳米颗粒能包被多种蛋白,如胰岛素、牛血清白蛋白、卵清白蛋白等,具有优良的装载容量和持久的稳定性,且包装的药物仍保持原有的活性,经鼻和经口免疫动物,均取得好的效果。

制备壳聚糖微颗粒-纳米颗粒方法有很多,如乳化-化学交联法、复凝聚法、疏水修饰法、沉淀法、喷雾干燥法和壳聚糖包衣法等。其中乳化-化学交联法和复凝聚法是最常用的制备方法。卫克文等采用乳化-化学交联法,基于聚阳离子多聚糖壳聚糖和聚阴离子多聚磷酸钠离子凝胶化过程和蛋白的羧基可以和壳聚糖的氨基之间发生静电相互作用。2003年Xu等研究了壳聚糖-蛋白纳米颗粒的制备参数,以牛血清白蛋白(BSA)作为模型蛋白。用TEM检测颗粒的直径为20-200 nm球形。在纳米颗粒中,TPP的多聚磷酸基交连于壳聚糖的氨基。试验的参数包括壳聚糖的分子量和脱乙酰程度和浓度、BSA 的初始浓度、聚乙二醇对纳米颗粒的修饰。得出壳聚糖分子量由Mr 10×103增加到Mr 210×103,BSA包装效率增加约2倍,稳定性也大幅度提高。增加壳聚糖的脱乙酰化程度从75.5%-92%,减低了释放速率。降低壳聚糖的初始浓度从3mg/mL到1mg/mL;改变BSA初始浓度从0.2-2 mg/mL,均显著提高了BSA包装效率。添加聚乙二醇,阻止BSA的包装,加速了释放。说明壳聚糖纳米颗粒的制备是简单易行的,根据要装载的蛋白,可调整各参数值,制备出所需的纳米颗粒。高稳定性、高的蛋白包装效率,可被修饰性,使壳聚糖成为一种新型纳米缓释系统。

一、壳聚糖纳米颗粒的制备

1、乙酸溶液的配制:取0.3mL乙酸溶于100mL无菌去离子水,配制成0.3%(v /v)乙酸溶液。

2、壳聚糖溶液的配制:取100mg壳聚糖(分子量分别为390KDa,脱乙酰程度90%,浙江玉环海洋生物公司)溶于50 mL上述乙酸溶液,配制成0.2% (w /v) 壳聚糖溶液,用0.22μm滤膜过滤。

3、多聚磷酸钠(TPP)溶液的配制:取20mg TPP溶于20mL消毒去离子水,配制成0.1%(w/v) 溶液。

4、空白壳聚糖纳米颗粒的配制:6mL TPP溶液加入15mL壳聚糖溶液,室温,磁力搅拌,自动形成乳白色悬液,用0.22μm滤器过滤。

5、GbpB-壳聚糖溶液的配制:将GbpB溶于壳聚糖溶液,以空白壳聚糖液作为对照,用核酸蛋白检测仪检测GbpB浓度。

6、GbpB-壳聚糖纳米颗粒的配制:取0.2mL TPP液加入0.5mL GbpB-壳聚糖溶液,室温,高速振荡,自动形成乳白色悬液。

二、GbpB-壳聚糖纳米颗粒物理性能的检测

1、取少量GbpB-壳聚糖纳米颗粒经透射电镜检查大小、粒径分散性、形态。

2、取少量GbpB-壳聚糖纳米颗粒,离心(10000 r/min,10 min),用空白壳聚糖纳米颗粒作空白对照,测上清中GbpB浓度,计算上清中GbpB量,用以下公式计算葡聚糖结合蛋白B(GbpB)包装容量和包装效率:

GbpB包装容量= (GbpB总量-上清中GbpB量) /(GbpB-壳聚糖纳米颗粒总量)。

GbpB包装效率= (GbpB总量-上清中GbpB量) /GbpB总量。

3、GbpB-壳聚糖纳米颗粒稳定性的检测:0-4周,定期取4℃贮存的GbpB-壳聚糖纳米颗粒,离心(10000 r/min,10min),用空白壳聚糖纳米颗粒作空白对照,测上清中GbpB浓度,计算上清中GbpB量,从而反应纳米颗粒的稳定性。

4、结果表明:GbpB-壳聚糖纳米颗粒大小为50-100 nm之间,类似球形,分散均匀,聚集成团块状分布。GbpB-壳聚糖纳米颗粒包装效率为98%,包装容量为45%。在4℃稳定,未检测到GbpB释出,表明GbpB与壳聚糖纳米颗粒结合稳定。CLSM 图像研究证实GbpB 包裹于壳聚糖纳米颗粒内,不仅仅结合于其表面。

三、免疫大鼠

1、实验动物及分组:SD雄性大鼠,100g左右(4周龄)。阴性对照组:未免疫组、空白壳聚糖纳米颗粒组。阳性对照组:GbpB组。实验组:GbpB-壳聚糖纳米颗粒溶液。

2、免疫途径:滴鼻免疫,5μL/每鼻孔。4、免疫时间:每只大鼠每次免疫剂量为100μg,2周后加强免疫一次。

3、采样及检测:分别于第2 、4、6、8周采集血液和唾液标本。收集样品(外周血清、唾液上清) ,用ELISA法检测血清中抗GbpB-IgG和唾液中抗GbpB-SIgA。

4、血清中特异性IgG 抗体水平:GbpB-纳米壳聚糖组与GbpB蛋白组之间无显著性差异(P >0. 05),这两组均显著高于阴性对照组。唾液中特异性GbpB抗体IgA水平:GbpB-纳米壳聚糖组与GbpB蛋白组无显著性差异,这两组均显著高于阴性对照组。

参考文献:

卫克文, et al. GbpB-壳聚糖纳米颗粒系统的构建及其经鼻免疫大鼠的实验研究. 口腔医学研究 2005,21(5): 488-491.

    日期:2014年07月11日  分类:免 疫
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