葡聚糖(DEX)纳米粒子的制备方法及抗原吸附方法

摘 要:

葡聚糖(dextran,DEX)由葡萄糖衍生的中性生物聚合物组成。由于其具有优良的生物相容性,在临床上广泛使用。因此,葡聚糖粒子可能是建立功能性纳米载体的良好平台。Shen等按照通用方法,将DEX纳米粒子与OVA和LPS混合,并吸附到粒子上。详细方法如下:

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葡聚糖(dextran,DEX)由葡萄糖衍生的中性生物聚合物组成。由于其具有优良的生物相容性,在临床上广泛使用。因此,葡聚糖粒子可能是建立功能性纳米载体的良好平台。

Shen等按照通用方法[5],将DEX纳米粒子与OVA和LPS混合,并吸附到粒子上。详细方法如下:

1、将7.69g葡聚糖T500(平均分子量为500 kDa,Pharmacosmos A/S, Holbaek, Denmark)加入30ml蒸馏水,溶解,配制成26%(w/v)的DEX溶液。

2、将20mg鸡卵清蛋白(OVA)(Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany)和125µg脂多糖(LPS,Sigma-Aldrich)用400µl PBS溶解,然后加入葡聚糖溶液。

3、加入30 ml于4°C预冷的植物油,用磁力搅拌器于4°C搅拌20 min,使溶液乳化。

4、将乳化液于冰浴中超声40s。

5、在室温下,将获得的乳液缓慢倒入200ml含0.1%(w/v)Tween 80 (STRVA, Feinbiochemica, Heidelberg/New York)的丙酮(acetone)溶液,并不停的搅拌,以沉淀DEX纳米颗粒。

6、搅拌6h后,用40µm直径的细胞过滤器过滤,以除去聚集的大颗粒。

7、获得的DEX粒子用含0.1% Tween 80的丙酮溶液洗3次,离心条件为3000g离心5min。

8、用2ml 1% Tween 80的丙酮溶液重悬DEX粒子,室温风干。

9、DEX粒子用PBS重悬,于4°C可放置数月,待用。

10、为了检测DEX结合的OVA蛋白浓度,用超声波破碎DEX粒子,用BCATM蛋白检测试剂盒(Pierce, Rockford, IL)检测释放出来的OVA蛋白浓度。结果表明,包被到DEX粒子的OVA浓度约为200 µg OVA/µl未稀释粒子。。

11、DEX粒子结合的LPS浓度用ToxinSensorTM chromogenic LAL endotoxin assay kit as recommended by the manufacturer (GenScript, NJ)检测。结果表明,LPS浓度约为13 pg/µl未稀释粒子。

12、电子显微镜观察。用透射电子显微镜观察分散在PBS溶液中的DEX颗粒的形态和粒径。结果显示DEX粒子呈球形,粒径约为20nm。

参考文献:

Shen, L., et al. (2013). "A trifunctional dextran-based nanovaccine targets and activates murine dendritic cells, and induces potent cellular and humoral immune responses in vivo." PLoS One 8(12): e80904.

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