痢疾志贺氏菌的毒力因子和致病机理

痢疾志贺氏菌的主要致病机理包括两个方面,一方面是侵袭肠上皮细胞并在肠上皮细胞之间扩散,这是致病的关键步骤,另一方面Ⅰ型痢疾志贺氏菌还可产生一种外毒素—志贺毒素,这也是一个重要的毒力因子,它可导致被感染者继发出血性结肠炎、溶血性尿毒综合症等疾病。本章对痢疾志贺氏菌的毒力因子和致病作用的讨论主要集中在其对肠上皮细胞的侵袭和志贺毒素对宿主细胞的作用上。

一、侵      袭

痢疾志贺氏菌能够侵袭肠上皮细胞并在肠上皮细胞之间扩散,虽然痢疾志贺氏菌与肠侵袭性大肠杆菌在遗传学上非常相似,但它们的侵袭机理、宿主和组织的特异性都各不相同。肠侵袭性大肠杆菌能够在人和其它很多动物的胃肠道定居,因此能引起胃肠道广泛区域的疾病。而痢疾志贺氏菌有高度的宿主和组织特异性,它通常只感染人或灵长类动物的结肠上皮细胞,从而引起细菌性痢疾。

志贺氏菌侵袭肠上皮细胞的能力是其重要的致病作用之一,志贺氏菌侵入肠上皮细胞以后,细菌的icsA基因编码产物使宿主细胞的肌动蛋白在细菌的一极多聚化,形成慧星尾结构,产生推动力,将细菌推到上皮细胞的边缘,继续推动使上皮细胞膜产生突起,突起被相邻的细胞内在化,细胞得以直接从一个上皮细胞扩散到另一个上皮细胞,而无需经过细胞外的过程。总体上,志贺氏菌对肠上皮细胞的侵袭可分为四个阶段:侵入肠上皮细胞、细胞内繁殖、细胞内的运动和细胞间的扩散、杀死宿主细胞和造成溃疡。

1.细菌侵入肠上皮细胞与细菌在宿主细胞内的繁殖

志贺氏菌与肠上皮细胞的接触对侵袭来说是必要的,现已知道志贺氏菌有菌毛存在,但菌毛与细菌在肠上皮细胞上的接触与定居是否有关尚不清楚,也没有证据表明志贺氏菌的菌毛与细菌的粘附有关。

过去曾认为痢疾志贺氏菌是通过肠道上皮细胞顶部的刷状缘侵入上皮细胞的。近年来的研究发现细菌首先侵入人肠道派伊尔小结(Payer’s patch)上的M细胞(图30-2),通过M细胞进入上皮下淋巴组织,在那里被巨噬细胞吞噬。痢疾志贺氏菌引起巨噬细胞凋亡,细菌从死亡的巨噬细胞中释放出来,志贺氏菌能够识别结肠绒毛基底部的整联蛋白α5β1,从肠上皮细胞的基底面侵入肠上皮细胞。细菌与上皮细胞接触以后激活Ⅲ型分泌系统,分泌侵袭性蛋白(Ipa),然后通过激活一个复杂的信息传导系统而引起接触部位的细胞骨架发生重排,细胞膜凹陷包围细菌形成吞噬泡,然后细菌裂解吞噬泡膜,细菌释放到胞将中去,在胞浆中扩散、增殖。在细胞内细菌大约每40分钟繁殖一代。

痢疾志贺氏菌通常感染结肠部位,且感染机体时先通过M细胞侵袭上皮下淋巴组织,再侵袭上皮细胞,导致淋巴小结相关上皮(FAE)的溃疡。这与志贺氏菌感染时主要在结肠形成粘膜溃疡的症状一致,因为在结肠处M细胞和淋巴小结比较丰富。

2.痢疾志贺氏菌在宿主细胞内的运动

痢疾志贺氏菌不是胞内寄生菌,但它可以在肠上皮细胞内繁殖。在侵入肠上皮细胞后,志贺氏菌先在宿主细胞内,继而在细胞间扩散,造成肠上皮细胞的溶解和坏死,肠粘膜发生溃疡和脓肿,继而引起更严重的疾病。

志贺氏菌在细胞内和细胞间的扩散是一个多步骤多因子的过程,有多个毒力因子的参与。志贺氏菌侵入肠上皮细胞,是由上皮细胞形成伪足,通过吞噬作用,形成吞噬体来实现的。志贺氏菌没有鞭毛,无动力。但志贺氏菌要在宿主细胞内及细胞间扩散就必需具有运动性,志贺氏菌的运动是通过上皮细胞内的肌动蛋白聚集来实现的。当志贺氏菌进入上皮细胞以后,志贺氏菌能够诱导F-肌动蛋白的聚集,肌动蛋白在聚集在细菌的一端呈极性分布,多聚化后形成一种类似慧星样的结构,继而趋动细菌的运动。通过这种方式志贺氏菌具有了运动性,其运动速度大约为0.4μm/秒。1968年Ogawa等第一次观察到志贺氏菌在细胞内的运动。志贺氏菌在宿主细胞内的运动能力与其致病性有密切关系。

一般而言,在细菌侵入上皮细胞20~40分钟左右,大部分细菌便脱离了吞噬泡结构,细菌继而与肌动蛋白相互作用,在侵入宿主细胞内2小时左右开始运动,具有自由运动的能力。在2~3个小时内便可占据整个细胞浆。

志贺氏菌在宿主细胞内的运动必须要有icsA/virG基因存在。IcsA/VirG是一种分子量为120KDa的外膜蛋白,它由1102个氨基酸残基组成,其蛋白质结构可以分为三个区域:N末端的信号肽序列(1~52位氨基酸残基),中间是含706个氨基酸残基的α区域(53~758位氨基酸残基),以及C末端的含344个氨基酸残基的β核区域(759~1102位氨基酸残基)。α区域位于细菌表面,而β核区域镶嵌于细菌外膜中,在膜上形成一种孔状结构,α区域就是通过这种孔状结构转移到细菌表面的。IcsA/VirG蛋白的这种结构也说明了它有可能是一种典型的自转运蛋白。

志贺氏菌在宿主细胞内要获得运动能力,肌动蛋白在细菌表面的聚集在这个过程中起着重要作用。志贺氏菌这种诱使肌动蛋白在细菌表面聚集的作用就是由IcsA/VirG蛋白诱导的。IcsA/VirG并不能直接诱导肌动蛋白的聚集,在IcsA/VirG蛋白N末端有一段富含甘氨酸的序列,它能与N-WASP(Neuronal Wiskoff-Aldrich syndrome protein)蛋白结合,N-WASP又能与Arp 2/3结合,因此在志贺氏菌表面形成的IcsA/VirG、N-WASP和Arp 2/3复合物从而介导肌动蛋白的聚集。

IcsA/VirG蛋白具有ATP酶的活性,可水解ATP,为肌动蛋白在细菌表面的聚集化提供能量。IcsA/VirG蛋白它在细菌的外膜呈典型的不对称分布。它只分布于细菌的一端,即分布于志贺氏菌和聚集的肌动蛋白丝尾部相连接的地方。虽然现在对志贺氏菌表面IcsA/VirG蛋白的这种不对称分布的原因还不很清楚,但这种不对称分布是志贺氏菌在宿主细胞内运动所必需的,也只有IcsA/VirG蛋白的这种不对称分布才能诱导肌动蛋白在细菌一端的聚集,从而推动细菌的运动。

在IcsA/VirG蛋白α区域N末端的2/3区域是介导志贺氏菌感染宿主细胞以后,肌动蛋白在细菌表面的聚集所必需的,这个区域含有6个富含甘氨酸的重复序列,它能够与宿主细胞蛋白质相互作用,从而诱导肌动蛋白的聚集。α区域C末端1/3的区域是IcsA/VirG蛋白在细菌表面不对称分布所必须的,该区域的缺失突变会使细菌表面的IcsA/VirG蛋白呈均匀分布,从而使志贺氏菌在宿主细胞内无法获得运动能力。事实上,IcsA/VirG蛋白的这种不对称分布与志贺氏菌染色体和质粒上的许多基因有关。

肌动蛋白在志贺氏菌一端的聚集过程中,宿主细胞中的一些因子也参与其中,包括α-辅肌动蛋白(α-actinin)、细丝蛋白(Filamin)、VASP(Vasodilator-stimulated phosphoprotein)、纽带蛋白(Vinculin)和N-WASP等。在这些蛋白中只有纽带蛋白和N-WASP能够与VirG直接结合。志贺氏菌感染宿主细胞以后,完整的纽带蛋白(120KDa)被裂解为一个90KDa的片段,裂解后的纽带蛋白暴露出一个位点,该位点有一个富含脯氨酸的区域,该区域能够与VASP结合。VASP到达志贺氏菌表面,转而诱使其它一些骨架蛋白参与到肌动蛋白聚集和志贺氏菌的运动中。

3.志贺氏菌向周围细胞的扩散

志贺氏菌侵入肠上皮细胞以后,大量繁殖,志贺氏菌再通过肌动蛋白的聚集获得了运动性,大量的志贺氏菌都趋向于宿主细胞的一端,在这个地方,宿主细胞形成伪足样的突起。在突起的顶端含有很多志贺氏菌,突起的直径为0.5μm,长度为20μm。

细菌在宿主细胞形成的突起可伸向邻近的上皮细胞,该突起又可被邻近的细胞包围,一旦被包围以后,这两个细胞的膜就发生裂解,从而使细菌从一个细胞直接转移到另一个细胞,而不用暴露在细胞外环境中(图30-2)。

已知染色体上的vacJ(Virulence-associated chromosome locus J)基因和位于侵袭性大质粒上的icsB基因与志贺氏菌在细胞间的扩散有关。vacJ基因编码着一个分子量为28KDa的蛋白质,在N末端含有一个信号肽,具有脂蛋白的特征,位于细胞表面。vacJ基因缺失菌株不能感染邻近细胞,细菌只是聚集在宿主细胞内。位于质粒上的另一个基因icsB也与细菌的扩散功能有关。IcsB蛋白的分子量为50KDa,位于细菌表面。icsB基因参与宿主细胞突起的膜结构的破坏,释放细菌进入邻近细胞。icsB基因是如何裂解突起的膜结构的机制目前仍不清楚。

4.痢疾志贺氏菌与肠上皮细胞的相互作用

痢疾志贺氏菌侵入肠上皮细胞以后,可引起局部炎症反应和多形核白细胞浸润,破坏上皮细胞间的紧密连接。细菌可以直接通过上皮细胞间质接触上皮细胞的基底膜,从而侵入上皮细胞,最终导致上皮屏障功能的完全丧失。志贺氏菌能够引起肠组织的炎症反应,改变肠道的通透性,从而使志贺氏菌能够更容易侵入细胞。志贺氏菌还能够引起肠道组织广泛性的脓肿和溃疡,这也是志贺氏菌病的特征病变之一。上皮细胞被志贺氏菌感染以后,能够释放出致炎因子,进而引起局部组织的炎症。因此志贺氏菌感染宿主细胞,并在细胞间扩散,是引起细菌性痢疾的基础。

志贺氏菌侵入宿主细胞以后,VirG蛋白能够结合并激活N-WASP蛋白,并激活核因子NF-κB,产生IL-8。IL-8能增加中性粒细胞(PMNs)的移行,中性粒细胞的移行又能够破坏宿主细胞的通透性,并增加志贺氏菌的侵袭力(图18-2)。

志贺氏菌穿过FAE的M细胞以后,到达淋巴小结,淋巴小结是巨噬细胞和树突状细胞集中的场所。志贺氏菌能够侵袭巨噬细胞,从而在2小时内就能引起巨噬细胞凋亡。志贺氏菌这种诱导巨噬细胞凋亡的现象是由其分泌的IpaB介导的,IpaB能够激活半胱氨酸蛋白酶,从而水解IL-1β和IL-18的前体,使之形成成熟的IL-1β和IL-18。最近的实验已经证实了在感染志贺氏菌的巨噬细胞中有IL-1β和IL-18。IL-1β能够破坏上皮细胞屏障和上皮组织的均一性,从而有利于细菌的侵袭和扩散,IL-1β还能增强炎症反应和组织损伤。IL-18是IFN-γ的诱导剂,而IFN-γ能够杀死志贺氏菌。因此志贺氏菌侵入巨噬细胞以后,一方面IL-1β促进细菌的侵袭和扩散,增强炎症反应和组织损伤,另一方面IL-18能够抑制细菌的生长,从而形成一种平衡。

二、志贺毒素(Shiga toxin,Stx)

Ⅰ型痢疾志贺氏菌所产生的志贺毒素属于一种细胞毒素,但它同时具有肠毒性和神经毒性。Stx也是痢疾志贺氏菌重要的毒力因子之一。志贺氏菌中只有Ⅰ型痢疾志贺氏菌能够产生Stx,它产生的Stx与肠出血性大肠杆菌O157:H7产生的Stx1完全相同。Stx包含有A-B亚基的基本结构,它是由一个A亚基和五个B亚基组成(图30-3)。志贺毒素A亚基分子量为32KDa,它可被蛋白酶水解为A1和A2两部分,A1和A2之间是通过一个二硫键相连。A1肽分子量为28KDa,它具有N-糖苷酶活性,能够抑制真核细胞的蛋白质合成,是志贺毒素的酶活性中心;A2肽分子量为4KDa,它的作用是将A1肽和B亚其连接起来。有报道指出,StxA亚基具有酶活性的最小结构域为第75-268位氨基酸残基构成的多肽。B亚基是由5个相同的7.7KDa的小亚基构成的五聚体,每个小亚基由69个氨基酸残基所构成。B亚基能够与特定的脂多糖受体球丙糖酰基鞘氨醇(Globotriaosylceramide,Gb3)结合。Gb3存在于真核细胞表面,在肠上皮细胞、肾内皮细胞和中枢神经细胞等细胞膜上含量较为丰富,是Stx的主要受体。经研究证实,组成B亚基的每个小亚基都可以与三个Gb3结合,因此一个Stx毒素的B亚基五聚体可与十五个Gb3受体结合,而且这五个聚合的单体排列在一个平面上。志贺毒素B亚基与受体结合以后,全毒素通过胞吞作用进入细胞,然后被转移至高尔基体,再到达内质网。最后A亚基被转至胞浆,作用于核糖体60S亚基,志贺毒素的A亚基发挥N-糖苷酶活性,切断核糖体60S亚基的28S rRNA第4232位腺嘌呤的N-糖苷键,从而阻止宿主细胞蛋白质的合成,这种作用会导致肾内皮细胞,肠上皮细胞,Vero细胞或Hela细胞,或者其它任何具有Gb3受体的真核细胞的死亡。有研究表明单独的A1肽的酶活性比志贺毒素全毒素的活性还强36倍。但若没有A2亚基,A1亚基就不能与B亚基结合成全毒素,由于失去了与受体结合的能力,也就不能对具有Gb3受体的细胞产生毒性作用。

在肠道中Stx能够杀伤上皮细胞,并引起严重的炎症反应和广泛的组织病理学损伤,从而导致血痢或无血性腹泻。痢疾志贺氏菌在肠道中所产生的Stx被认为吸收进了血液(尽管临床上在病人的血液中未检出这种毒素,但最新的研究表明它可以与红细胞膜上的受体结合),从而导致HUS。据认为,HUS的发病机制是由于Stx引起肾小球内皮细胞的损伤,从而降低肾小球滤过率,引起血小板减少,微血管溶血性贫血,最后导致肾衰竭。

很多实验表明Stx与腹泻和小肠结肠炎密切相关。最早的实验是将纯化的Stx注入结扎的家兔的肠管,结果导致积液和组织损伤。这可能是由于Stx选择性地杀死肠绒毛有吸收功能的上皮细胞从而导致分泌相对增加。与LT或CT不同的是,Stx并不增加氯离子的分泌。静脉注射Stx能导致家兔非出血性腹泻,说明该毒素除了与绒毛尖端细胞特异结合外还有其它作用机制。

有研究表明痢疾志贺氏菌I型Stx阴性突变株作用于猴子所引起的疾病症状要比Stx阳性株轻微。这两株菌导致相同的腹泻量,但是Stx阳性株所引起的腹泻粪便中检测出更多的红细菌,并且结肠粘膜微血管的损伤也更严重。

尽管在HUS病人的血液中还没有检测到Stx,但估计Stx在肠道产生后能够被吸收入血。在体外培养的肠上皮细胞,Stx可以穿过细胞单层而不引起细胞变化,通路可能是穿过细胞,也可能是穿过细胞间隙。细菌内毒素,或者其它的引起炎症的因素对肠上皮的损伤都会增加Stx向血液中的转移。尽管还没有动物模型证明Stx能引起典型的HUS的肾脏病理变化,但是给家兔静脉注射Stx能够在中枢神经系统和肠道引起血管病变,而这些器官都是Gb3受体最多的地方。家兔肾脏缺乏Gb3受体,所以在家兔模型中很少或看不到肾脏损伤。人的肾脏组织Gb3受体较为集中,有实验表明Stx对体外培养的人肾内皮细胞具有细胞毒性,而且能够引起典型的肾脏组织病理学变化,包括肾小球内皮细胞肿胀和血小板及纤维素在肾小球的沉积。Stx对肾小球内皮细胞的损伤导致肾小球毛细血管腔的狭窄和微血管系统被血小板和纤维素所阻塞,从而导致肾小球滤过率下降,最终导致HUS典型的急性肾衰。

有研究表明Stx还有诱生细胞因子的作用,例如TNF-α和IL-6。TNF-α和IL-6能够加强Stx对体外培养的人血管内皮细胞的细胞毒性作用。这两种细胞因子,再加上LPS,能够诱导内皮细胞Gb3的表达从而促进Stx与靶细胞的结合,临床发现,HUS病人的血清和尿中的IL-6水平升高,并且IL-6的水平的高低与疾病的预后密切相关。由此可知Stx诱生的细胞因子也在其致病作用中扮演着重要角色,Stx的致病作用是Stx直接的细胞毒作用和诱生出的细胞因子的间接作用相辅相成的结果。

三、铁的利用

志贺氏菌的侵袭力是其重要的致病机制之一。志贺氏菌能否引起疾病,取决于它是否能够克服宿主的抗菌屏障和逃避免疫系统,从而侵入宿主细胞,并在宿主细胞内繁殖、运动和引起宿主细胞的损伤。在这个过程中除了志贺氏菌本身的侵袭能力外,还与营养的摄取有关。某些组织是否具有某种特殊的营养物质,可能会成为引起感染部位的最主要的决定因素。一个关键而又往往缺乏的物质就是铁离子。宿主细胞内的游离铁往往被运铁蛋白(Transferrin)和乳铁蛋白(Lactoferrin)等一些分子螯合着,细菌不能利用。志贺氏菌通过铁载体(Siderophores)的作用,从宿主细胞中获得铁离子的能力,也是其毒力的决定因素。在宿主细胞内,铁离子普遍缺乏,低铁往往是诱导毒力基因表达的信号。

许多病原菌都具有结合并转运亚铁血红素(Heme)的能力,因为在宿主细胞中亚铁血红素是铁离子最重要的来源,因此病原菌感染宿主细胞后多以亚铁血红素作为自身的铁源。在痢疾志贺氏菌感染周期中,细菌在宿主上皮细胞质中存活并繁殖这段时间在其致病作用中具有重要意义。志贺氏菌在宿主细胞内存活并繁殖,必须获得充足的营养,其中包括铁的摄取。

在宿主细胞内细菌有多种摄取铁的方法,有的通过合成和转运含铁物质、低分子量的铁复合物,并通过更高的亲合力与宿主竞争铁离子;有的直接利用宿主细胞内的铁源,如亚铁血红素、血红蛋白、运铁蛋白和乳铁蛋白等。痢疾志贺氏菌合成并利用儿茶酚铁肠杆菌素,它可以亚铁血红素作为唯一的铁源。痢疾志贺氏菌转运亚铁血红素依赖于TonB蛋白及其附属蛋白ExbB和ExbD。TonB蛋白为铁复合物通过细菌外膜提供能量,TonB跨越细菌周质,将能量从细胞质膜转移到外膜受体上,使铁离子复合物穿过外膜进入周质内,内膜渗透酶再将之转移到细菌细胞质内。TonB蛋白C末端可直接和外膜上与铁离子转运有关的受体相互作用。TonB的N末端锚定在细胞质膜蛋白上,并与ExbB相互作用。ExbB和ExbD的作用是稳定和重复利用TonB蛋白。

有研究表明TonB是痢疾志贺氏菌具有毒力特征所必需的。痢疾志贺氏菌在宿主细胞内生长需要TonB,TonB可能还与痢疾志贺氏菌在宿主细胞内摄取其它一些营养物质有关,也可能与痢疾志贺氏菌毒力特征有关的复合物的转运有关。

四、运  动  性

一般认为志贺氏菌没有运动性,鞭毛是细菌的运动器官,而志贺氏菌没有鞭毛,因此也就不具有运动性。但Almamun等的研究发现,在弗氏志贺氏菌和宋内氏志贺氏菌染色体上发现了编码鞭毛蛋白的fliC基因,而鞭毛蛋白是细菌鞭毛的主要组成部分。后来在鲍氏志贺氏菌和痢疾志贺氏菌中也发现了fliC基因。将这几个菌株的fliC基因与其它具有运动性的菌株fliC基因进行序列分析比较,结果表明它们之间具有很高的同源性。利用大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌一些编码鞭毛的基因作为探针,与志贺氏菌进行杂交试验,结果也表明志贺氏菌含有大部分编码鞭毛所需的基因。通过进化和系统发生学研究表明志贺氏菌是在进化过程中逐渐丢失其运动性的,大约在105年以前志贺氏菌也具有鞭毛,具有运动性。但是志贺氏菌在进化过程中为什么会丢失鞭毛,从而失去运动性,又是怎样丢失的呢,这些目前都还不清楚。

Giron等曾在1995年报道几株新从临床分离的志贺氏菌具有少量鞭毛,并且具有运动性。这与通常的认为志贺氏菌没有运动性相矛盾,为什么会有这种情况呢?有人认为志贺氏菌这种具有鞭毛的返祖现象可能是生存选择的结果。在肠道内,志贺氏菌如果具有鞭毛,它就能通过运动“找到”合适的肠道侵袭部位,进而引起感染,而没有运动性的志贺氏菌侵袭肠上皮细胞的可能性就要小一些。在实验室细菌培养和保存过程中,鞭毛不具有任何作用,对细菌来说反而是一种负担,因为鞭毛会消耗大量的能量。因此在临床上具有运动性的志贺氏菌在实验室通过几代培养以后也可能会丢失其运动性。通过这项研究也为志贺氏菌在进化过程中丢失鞭毛的原因提供了线索。

    日期:2014年02月19日  分类:病原菌
    A+

除注明外,本站内容由 细菌之家 原创或整理,转载请注明出处及链接。

本文永久链接: http://www.bacteria.cn/html/2014/76.html

  • 请您留言:专业水平所限,谬误之处在所难免。如您发现不正之处,请在下面留言,谢谢!

发表评论

:?: :razz: :sad: :evil: :!: :smile: :oops: :grin: :eek: :shock: :???: :cool: :lol: :mad: :twisted: :roll: :wink: :idea: :arrow: :neutral: :cry: :mrgreen:

图片 表情