壳聚糖纳米微囊(Chitosan nanocapsules)和乙肝病毒表面抗原制备纳米疫苗

摘 要:

壳聚糖(CS)即脱乙酰壳多糖,CS纳米颗粒具有很好的佐剂活性,在激活粘膜免疫方面具有优势。Vicente等设计了CS纳米微囊(CS nanocapsules,CSNC)。CSNC具有多层球状结构,粒径约为200nm。小鼠实验表明,带正电荷的CSNC:HB刺激机体产生的抗体水平显著高于铝胶佐剂,正电荷CSNC-HB还能诱导细胞免疫反应。

关键词: ,

自20世纪30年代以来,铝盐(主要以氢氧化铝(Al(OH)3)或磷酸铝(AlPO4)的形式)作为疫苗的佐剂,在全世界广泛使用。但尽管铝佐剂被广泛使用,它仍然具有一些缺点,如在注射部位发生炎症反应、冷冻后效力会下降、倾向于诱导强烈的Th2型免疫反应。因此,科学家们都在致力于研究新的佐剂或疫苗递送载体。

其中一个很有前途的方法是设计聚合纳米载体(polymeric nanocarriers),这种载体能够保护抗原不被降解,促进抗原递呈细胞(antigen presenting cell,APC)摄取抗原,并控制抗原缓释。

脱乙酰壳多糖(Chitosan,CS)也叫壳聚糖,是疫苗递送最常用的生物材料之一。由于其粘膜粘附和强渗透能力,在激活粘膜免疫方面具有优势。利用壳聚糖干粉与单磷酰脂质A(monophosphoryl lipid A,MPLA)和抗原混合制备的鼻腔喷雾接种抗诺如病毒(norovirus)疫苗目前正处于I期临床实验阶段。利用CS纳米颗粒制备的喷雾疫苗表现出了良好的前景,此外,CS纳米颗粒还具有很好的佐剂作用。

由于壳聚糖具有很多优点,Vicente等基于CS设计了新的纳米载体,被称为CS纳米微囊(CS nanocapsules,CSNC)。CSNC具有多层球状结构,并利用重组乙肝病毒表面抗原(rHBsAg)作为模型抗原,来研究CSNC作为单剂疫苗的佐剂活性。

一、材料

1、超纯壳聚糖盐酸盐(chitosan (CS) hydrochloride salt,Protasan UP CL 113, MW 125 kDa, acetylation degree of 14%)购自Novamatrix (Sandvika, 挪威);

2、Miglyol 812 (M812)是一种中性油,其成份是由中链脂肪酸(6-8 C)组成的甘油三酯,M812是由Sasol Germany GmbH (Witten, Germany)捐赠;

3、乳化大豆L-α-卵磷脂(The emulsifier soybean L-a-lecithin)Epikuron145V由Cargill (Barcelona,西班牙)惠赠;

4、重组乙肝病毒表面抗原(rHBsAg或HB)(MW 24 kDa)由Shantha生物技术公司(Hyderabad,印度)惠赠,抗原蛋白溶于PBS中,蛋白浓度为0.16 mg/ml。

二、溶剂置换法制备壳聚糖纳米微囊(CSNC)

按文献(Prego C, et al. Chitosan nanocapsules as carriers for oral peptide delivery: Effect of chitosan molecular weight and type of salt on the in vitro behaviour and in vivo effectiveness. J Nanosci Nanotechnol. 2006,6: 2921–2928.)的方法进行。

简言之,将40mg和0.25mL M812溶解在乙醇与丙酮的混合液中。将此有机相倒入含0.05% CS的水溶液中,并不断进行磁力搅拌,就形成了CSNC,溶液外观呈乳白色。然后,在真空下将有机溶剂蒸发。溶液在15ºC,42000g超速离心1小时,就得到CSNC悬液。最后,CSNC悬液用水稀释到CS的终浓度为1 mg/mL。

Briefly, 40 mg and 0.25 mL of M812 were dissolved in a mixture of ethanol and acetone. This organic phase was poured under magnetic stirring upon an aqueous solution composed of CS 0.05% in water. CSNC were immediately formed, as noted by the milky appearance of the resulting solution. Then, the organic solvents were evaporated under vacuum. Finally, CSNC suspension was isolated by ultracentrifugation (OptimaTM L-90K Ultracentrifuge, Beckman Coulter; Fullerton, CA) at 42000xg for 1 hour at 15ºC and then resuspended in water to a final concentration of CS in the formulation of 1 mg/mL.

最终制备的CSNC含有由Miglyol 812 (M812)组成的油性核、卵磷脂壳和CS壳的球形结构,表面呈正电荷。CSNC的粒径约为200nm。

三、制备携带乙肝病毒表面抗原的壳聚糖纳米微囊及其理化特性研究。

将HB抗原组装到CSNC的表面是由强的静电相互作用实现的, 因为CSNC表面是带正电荷的多糖,而抗原粒子带负电荷(水溶液中为220mV)。为了实现这一目的,对HB储存液进行脱盐,并通过超滤的方法浓缩到浓度为0.5 mg/mL。处理后的HB溶液立即与CSNC(CS的浓度为1 mg/mL)混合,室温作用1h。通过2种不同的方法:(1)增加抗原量(25、50、100、250 mg);(2)维持恒定的抗原量(25 mg),但是改变CSNC的浓度。从而可以制备出不同比例的纳米系统,CSNC:HB的比例从1:0.025到1:12.8不等。

CSNC结合HB抗原后,粒径约为250nm。

四、对结合到CSNC表面的HB抗原进行定量

通过间接方法对结合到CSNC表面的HB抗原进行定理。超速离心 (42000 g,1h,15ºC) 后,用ELISA方法检测上清中的HB抗原量,从而计算出结合到CSNC表面的HB抗原。

五、HB-CSNC的稳定性

1、将HB-CSNC悬浮液放置于4ºC。每隔1周取样进行检测,共检测时长为1个月。

2、冻干保存HB-CSNC。利用冷冻干燥法来增加HB-CSNC的稳定性。HB-CSNC以不同的糖作为冻干保护剂(蔗糖和海藻糖),浓度分别为0、1、2.5、5%。HB-CSNC悬浮液和冻干保护剂溶液中按1:1(体积比)混合,分装在5毫升冻干玻璃小瓶中。小瓶中在-20ºC缓慢冻结,然后放置-35ºC冷冻。在此温度下在高真空中进行初步干燥(升华)反应约40小时。第二步干燥(水分解吸)持续8小时,在真空状态下温度逐渐上升至20ºC。最终的冻干品用超纯水温和混合悬浮并分析其物理化学性质。

结果表明:低浓度的糖(0、1、2.5%)作为冻干保护剂,溶解后纳米粒子的粒径显著增大,而5%浓度的糖作为冻干保护剂,溶解后纳米粒子的大小与冻干明相似,没有显著差异。

海藻糖(Trehalose)通常是首选的生物大分子冻干保护剂,因为它的低吸湿性、容易形成更灵活的氢键和非常低的反应性。由于HB-CSNC疫苗中,HB抗原暴露在表面,因此本研究选择海藻糖作为HB-CSNC的冻干保护剂。

六、免疫实验

1、HB铝胶佐剂的制备。

将HB吸附到氢氧化铝(HB-铝胶)作为阳性对照。HB和氢氧化铝(AlhydrogelTM,Sigma-Aldrich)溶液按3:1的体积比混合,在4ºC轻柔搅拌孵育30min。然后,将悬液离心(10000g,10 minutes,4ºC),将沉淀重悬于足量的生理盐水。

2、免疫及样品收集

表面电荷对CSNC的佐剂活性进行评价。雌性BALB/c分为每组10只,分别用带正电荷或电负电荷的CSNC:HB、HB-铝胶进行免疫,免疫剂量按HB量为10μg/只小鼠。免疫次数分为2种方式,一种进行单次免疫,另一种分别在第0周和第4周免疫。免疫途径为后腿肌肉注射。初免后,每月采血1次,采集时长为27周。

结果表明带负电荷的CSNC:HB刺激机体产生的抗体水平比铝胶佐剂低,而带正电荷的CSNC:HB刺激机体产生的抗体水平显著高于铝胶佐剂。

对于冻干制剂的生物学评价,冻干瓶中加入0.5mL超纯水,轻柔混匀。小鼠被随机分为2组,每组10只,分别用冻干溶解的CSNC:HB和HB-铝胶进行免疫,均免疫2次,间隔4周。免疫方式同上。然后在28、56、84和112天采血制备血清,用ELISA方法检测血清中IgG水平。

正电荷CSNC-HB引起的免疫反应类型研究

CSNC-HB免疫小鼠后,通过检测并计算血清中IgG1和IgG2a的比例,可以反应其诱导的免疫反应类型。通常高水平的IgG1主要是Th2型体液免疫,而IgG2a代表Th1型细胞免疫。结果表明正电荷CSNC-HB能够引起细胞免疫反应。

参考文献:

Vicente S, et al. A polymer/oil based nanovaccine as a single-dose immunization approach. PLoS One 2013,8(4): e62500.

    日期:2014年06月20日  分类:免 疫
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