猪链球菌电转化感受态细胞的制备及电转化方法

摘 要:

猪链球菌属于革兰氏阳性菌,电转化感受态细胞的制备方法与大肠杆菌等阴性菌不同。下面详细介绍了猪链球菌电转化感受态细胞制备所需试剂CTB、EB和含10%甘油的EB缓冲液的配制方法,以及电转化方法。

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猪链球菌属于革兰氏阳性菌,电转化感受态细胞的制备方法与大肠杆菌等阴性菌不同。下面介绍猪链球菌电转化感受态细胞的制备及电转化方法。

一、试剂

1、CTB:500mL:分别称取MnCl 5.44g,CaCl2 1.10g,KCl 9.32g,PIPES 1.52g,加入去离子水450mL,用玻璃棒搅拌至溶解。用10mol/L KOH调PH值至 6.7,用去离子水定容至 500mL,用滤纸过滤,15psi(1.05kg/cm2)高压下蒸汽灭菌20min,4℃保存。

2、EB:500mL:分别称取Sucrose(蔗糖) 51.35g,K2H(PO4 )3 0.23g,加入去离子水450mL,用玻璃棒搅拌至溶解。用10mol/L KOH调PH值至8.4,用去离子水定容至500mL,用0.22mm孔径滤器过滤除菌,4℃保存。

3、甘油:取出约100mL甘油,装入瓶中,在 15psi(1.05kg/cm2)高压下蒸汽灭菌 20min,4℃保存。

4、10%甘油EB:100mL:取过滤除菌的EB溶液90mL,加入高压灭菌的甘油10mL,充分混匀,4℃保存。

二、猪链球菌电转化感受态的制备及电转化方法

1、取-80℃冻存的猪链球菌(SS)菌种,在无菌条件下划线接种于不含抗生素的链球菌琼脂平板,37℃温箱中过夜培养;

2、挑取SS单菌落接种于5mL无抗性的链球菌培养基中,37℃静置培养过夜;

3、取过夜培养的SS菌液5mL加入到100mL链球菌培养基中,37℃静置培养5-6h(OD600值为0.3-0.5),冰浴冷却;

4、将冰浴冷却的SS菌液转移到无菌的、冰预冷的离心管中,于4℃ 6000r/min离心5min,弃上清;

5、在冰浴条件下每50mL初始培养物加入30mL CTB重悬菌体,4℃ 6000r/min离心5min,弃上清;

6、再加入30mL CTB重悬菌体,冰浴30min,4℃ 6000r/min离心5min,弃上清;

7、每50mL初始培养物加入30mL EB Buffer洗涤菌体,4℃ 6000r/min离心5min;

8、收集菌体,按上一步重复洗涤1次;

9、每50mL初始培养物用2mL冰预冷的含10%甘油的EB Buffer重悬菌体,分装于无菌的1.5mL离心管,每管200μL,-80℃超低温冰箱保存备用。

10、电转化:取冻存的SS感受态冰浴溶解,将重组质粒5μL加入到感受态中,充分混匀,在无菌条件下转移至电转杯,2400V电击约5ms。将电转产物转移到无菌离心管,加入无抗性的链球菌培养基400μL,充分混匀,放入温箱静置复苏,涂板。

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