大肠杆菌高密度发酵控制乙酸产量的方法

摘 要:

大肠杆菌高密度规模发酵时,乙酸作为副产物会大量积累,控制乙酸的生成被认为是大肠杆菌高密度发酵生产重组蛋白过程中最大的问题与难题。预防乙酸产生的措施主要包括:通过控制比生长速率来减少乙酸的产生、透析培养、 控制葡萄糖的浓度来控制乙酸产生。

关键词:

以葡萄糖为培养基进行大肠杆菌高密度规模发酵,当细菌快速生长时,乙酸作为副产物会大量积累。乙酸对细胞生长和目标蛋白生产均有负面影响,一般认为,在好气性条件下,5~10g/L 的乙酸浓度就能对滞后期、最大比生长速率、菌体浓度以及最后蛋白收率等都产生可观测到的抑制作用。当乙酸浓度大于10或20g/L 时,细胞将会停止生长,当培养液中乙酸浓度大于12g/L 后外源蛋白的表达完全被抑制。此外,乙酸的产生也使得碳源分流,降低细胞及重组蛋白的得率。因此,控制乙酸的生成被认为是大肠杆菌高密度发酵生产重组蛋白过程中最大的问题与难题。

在重组大肠杆菌高密度发酵过程中,当供氧不足或细胞生长过快时均会产生乙酸。在氧气供应充足的情况下,乙酸的形成速率与细胞生长速率直接相关:当细胞生长超过临界比生长速率时,大肠杆菌就会产生乙酸,且其生成速率随着比生长速率的增加而增大。在高密度发酵过程中,培养物的生长速率由限制性底物的补料速率决定,因此,乙酸形成速率就与补料速率直接相关。另一方面,不管生物反应器的供氧多快,大肠杆菌消耗氧的能力有限。该氧消耗速率的极值对应于乙酸开始生成的细胞比生长速率。

预防乙酸产生的措施:

1、通过控制比生长速率来减少乙酸的产生

比生长速率越高,乙酸产生越多,当比生长速率超过某个值时,乙酸开始产生。可以通过降低温度,调节酸碱度,控制补料等方法来降低比生长速率。

2、透析培养

在大肠杆菌的培养过程中可以用透析技术除去发酵液中的有害物质,降低乙酸含量从而实现重组菌的高密度发酵和产物的表达。采用透析过程移除生长抑制代谢物已被成功用于糖浓度恒定的重组蛋白的高密度发酵。透析过程是基于浓度梯度,不同的溶质分子由于其不同的扩散行为通过半透膜而达到分离的目的。类似的,乙酸也可被大孔离子交换树脂从发酵液中移除。然而,透析培养移除乙酸同时趋向于移除细胞生长所必须的营养物质,而且,不能改善碳源向乙酸分流的问题。

3、 控制葡萄糖的浓度

葡萄糖会引起乙酸生成,用甘露糖和果糖代替葡萄糖可降低乙酸积累量。葡萄糖是大肠杆菌发酵过程中重要的碳源之一,用其作碳源是要将其控制在一个较低的水平上,以减少乙酸的产生。

常用的控制方法主要有:

恒pH法:大肠杆菌会代谢葡萄等产生乙酸,使pH 值下降。因此可通过pH值的高低作为控制葡萄糖的指标,该法的缺点是pH 的变化不完全是由葡萄糖代谢的结果,容易造成补料体系出错。

恒溶氧法:菌体代谢时会消耗氧,使溶氧下降,当葡萄糖浓度低到一定程度时菌体代谢下降,消耗氧能力下降,溶氧上升。因此,根据溶氧曲线补加葡萄糖,保持溶氧恒定,可以控制葡萄糖在一定的水平。

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