高密度发酵时培养基组成及特殊营养物的优化策略

摘 要:

为了提高发酵的细胞密度和生产率,需要对微生物生长的生长环境进行优化,包括生长培养基的组成、培养物理参数(pH、温度和搅拌)及产物诱导条件等。优化的目的在于保证细胞生长处于最适的环境条件之下,避免营养物过量或不足、防止产物降解以及减少有毒产物的形成。

关键词:

为了提高发酵的细胞密度和生产率,首先需要对微生物生长的物理和化学环境进行优化,包括生长培养基的组成、培养物理参数(pH、温度和搅拌)及产物诱导条件等。优化这些参数的目的在于保证细胞生长处于最适的环境条件之下,避免营养物过量或不足、防止产物降解以及减少有毒产物的形成。

1、培养基组成的优化

培养基中通常含有碳(能)源、氮源,以及微营养物如维生素和微量元素,这些营养物的浓度与比例,对实现生产重组微生物的高密度发酵是很重要的。例如,过量的Fe2+和CaCO3与相对低浓度的磷酸盐可促进黄曲霉生产L-苹果酸;链霉菌在60-80 mmol/L CO32-存在下,其丝氨酸蛋白酶生产能力可提高10倍之多;在重组微生物达到高细胞密度后,限制磷酸盐浓度可使抗生素和异源白介素1的产率显著提高。此外还发现,限制精氨酸的浓度虽然会抑制细胞的生长,但比起精氨酸充足时细胞生长优良的情况,其重组b-淀粉酶的产量可提高2倍。

培养基中复合氮源的种类对重组大肠杆菌的高密度发酵也非常重要。一般地,当流加培养基中含有酵母膏时,重组蛋白不稳定;而当流加培养基中含有蛋白胨时,大肠杆菌不能再利用其所产生的乙酸。将酵母膏和蛋白胨都加入流加培养基中,不但所生产的重组蛋白非常稳定,细胞还能再利用代谢合成的乙酸,这是一种非常有趣的代谢机制。

恒化技术可用于优化精氨酸营养缺陷型大肠杆菌X90的生长培养基。使该菌株以0.4 h-1的比生长速率在含精氨酸的基本培养基上生长,待培养达到稳定状态后,在恒化器内分别加入氨基酸、维生素和微量元素来考察这些物质对菌体生长和精氨酸合成的影响。结果表明,由于氨基酸生物合成途径的末端产物抑制作用,加入某些氨基酸后,细胞生长反而受到抑制。加入NH4Cl后细胞量则出现了戏剧性的增长。而添加维生素对菌体生长基本上没有任何影响。通过计算生物量对每种基质的产率,最终可以确定高密度发酵培养基的组成,在此优化培养基上,大肠杆菌X90细胞密度可达到92 g/L,同时形成56 mg/L的胞外重组蛋白酶。

2、特殊营养物的添加

在某些情况下,向培养基中添加一些营养物质能提高生产率。这些营养物的作用有可能是作为产物的前体,也有可能是阻止产物的降解,例如,在培养重组大肠杆菌生产氯霉素乙酰转移酶(一种由许多芳香族氨基酸组成的蛋白)时添加苯丙氨酸,可将酶的比活力提高大约2倍;在培养重组枯草芽孢杆菌生产b-内酰胺酶的培养基中添加60 g/L的葡萄糖和100 mmol/L的磷酸钾能使重组蛋白的稳定性显著提高。其原因可能是由于宿主细胞产生的多种胞外蛋白酶的活性被抑制,从而防止了重组蛋白的降解。

在生长培养基中添加特殊物质有时还能以一种未知的机制提高生产率。例如,在摇瓶培养Micromonospora cbersina时添加碘化钠可使dynemicin A的产量提高35倍,但在小型反应器中却无法重复这一结果。

3、限制代谢副产物的积累

培养条件的控制对代谢副产物的形成影响甚大。在分批或流加培养中,某些营养物的浓度过高均会导致Crabtree效应的产生。在这种效应下,酿酒酵母会产生乙醇,大肠杆菌则会产生过量乙酸,一旦生成乙酸,细胞生长及重组蛋白的生产均会受到抑制。大肠杆菌形成乙酸的速度依赖于细胞的生长速度和培养基的组成。业已确证,如果在培养基中添加复合营养物(如大豆水解物),则会增加乙酸的积累量。针对如何减轻由于乙酸积累而产生的负面影响,众多研究者进行了大量工作,如利用循环发酵技术来限制乙酸在重组大肠杆菌高密度培养中的积累。近来也有研究表明,添加某些氨基酸能减轻乙酸的抑制作用。如在培养基中添加10 mg/L的甘氨酸能显著促进大肠杆菌合成重组b-淀粉酶和a-内酰胺酶,并能刺激酶从周质向培养基中释放,但此时仍有乙酸伴随生成。

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