利用重组报告噬菌体检测模拟血液样品中的炭疽芽孢杆菌

摘 要:

将发光报告基因luxAB整合到溶原性噬菌体Wß的非必须区,构建出生物发光报告噬菌体,并建立快速检测临床标本或环境样品中炭疽芽孢杆菌或炭疽芽孢的方法。模拟血液样品最少可以检测到10E2 CFU/mL菌。检测炭疽芽孢,最短60min即可出现发光信号。

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生物发光报告噬菌体(bioluminescent reporter phage)Wß::luxAB可以用来快速检测临床标本或环境中的炭疽芽孢杆菌或炭疽芽孢。将细菌的报告基因luxA和luxB整合到溶原性噬菌体Wß的非必须区,构建出报告噬菌体Wß::luxAB。利用噬菌体可以特异性检测样品中活的炭疽芽孢杆菌并表现出生物发光表型。这种方法不需要进行样品预处理和细菌分离,只需要将噬菌体和细菌简单混合即可。对于处于增殖状态的细菌,最短只需要16min即可检测到发光信号。产生信号的强度和时间与原始的细菌数量直接相关。细菌量为10E3 CFU/ml时,60min内可检测到。利用Wß::luxAB检测炭疽芽孢,60min内即可使芽孢发芽并出现发光信号。

报告噬菌体Wß::luxAB检测血液中炭疽芽孢杆菌

1、加有柠檬酸钠的人全血与炭疽芽孢杆菌Sterne株混匀(990μl血液加10μl菌液),未加菌液的血液作为阴性对照。

2、50μl血液样品用BHI培养基稀释20倍(1:20),37℃培养4h。

3、250g离心1min,去除红细胞,上清转移到新的离心管,10 000g离心4min。

上述稀释、离心的目的是为了将血液对噬菌体感染细菌及生物发光的抑制作用降到最小。

4、沉淀用250μl上清重悬,加入终浓度为2.5×10E7 PFU/mL的报告噬菌体Wß::luxAB。

5、37℃培养60min,检测生物发光。

血液是炭疽病的最常见的标准临床样品,利用报告噬菌体检测模拟血液样品结果表明,最少可以检测到10E2 CFU/mL菌的模拟样品,检测总时间为5h(预培养4h,检测1h)。

参考文献:

Schofield DA, Sharp NJ, Vandamm J, et al. Bacillus anthracis diagnostic detection and rapid antibiotic susceptibilitydetermination using 'bioluminescent' reporter phage. J Microbiol.Methods.  2013,95(2):156-161. doi: 10.1016/j.mimet.2013.08.013.

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