构建生物发光重组噬菌体,建立炭疽芽孢杆菌快速检测系统

摘 要:

炭疽的快速诊断非常重要,以溶原性噬菌体Wß为基础,将生物发光基因luxAB基因通过同源重组方式整合到炭疽芽孢杆菌溶原性噬菌体Wß的非必需区,构建出重组噬菌体Wß:: luxAB。重组噬菌体能特异性的感染炭疽芽孢杆菌并使之具有发光表型。

关键词: ,

由于炭疽感染后病情急,如不及时诊断治疗,病死率高,因此对于炭疽的快速诊断非常重要。炭疽芽孢杆菌的传统检测鉴定方法至少需要24-48h,PCR方法需要样品的预处理,尤其是进行环境样品难测时,难以区分活菌和死菌。

利用重组报告噬菌体建立的病原菌检测方法已被用于李斯特菌沙门氏菌、分支杆菌和出血性大肠杆菌O157。利用特异性的炭疽芽孢杆菌广谱噬菌体,建立相应的报告噬菌体检测技术也具有可行性。McCloy等于1951年鉴定出一个炭疽芽孢杆菌温和噬菌体Wß。Wß能够感染所有无荚膜芽孢杆菌(测试了171株),不感染其它芽孢杆菌,如Bacillus megaterium、Bacillus pumilis、Bacillus firmus、Bacillus subtilis、Bacillus mycoides、Bacillus coagulans、Bacillus licheniformis、Bacillus circulans等。但有研究表明Wß会感染少量蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)菌株。1955年,Brown和Cherry分离到γ噬菌体,γ噬菌体是裂解性噬菌体,来源于Wß噬菌体。Wß和γ都具有炭疽芽孢杆菌特异性。与Wß不同,γ能够裂解有荚膜的炭疽芽孢杆菌。在最近的一项研究中,利用来源于巴基斯坦、加拿大、阿根廷、英国、美国和南非的51株炭疽芽孢杆菌,结果γ噬菌体能够感染其中的49株菌。由于γ噬菌体具有种属特异性和菌株广谱性,γ噬菌体裂解实验被美国CDC和公共卫生实验室作为鉴定炭疽芽孢杆菌的标准方法,我国也将该方法写入了炭疽的诊断标准中。

Wß和γ噬菌体具有相似的形态,都属于尾噬菌体属长尾噬菌体科,头部呈正二十面体结构,具有一个可收缩的长尾。Wß和γ都是双链DNA病毒基因组全长分别为40864和37373bp。全基因组序列分析表明,γ噬菌体很可能是由Wß噬菌体进化而来。它们在基因组上的差异主要体现在:(1)wp25和wp26之间(溶原性位点)有25bp的缺失;(2)wp28和wp29之间有2003bp的缺失,该位点编码C1抑制蛋白的同系物,与噬菌体的溶原性有关;(3)在尾纤基因(tail fibre gene)wp14中有69个碱基突变。这些基因组上的差异也表明了这两个噬菌体为什么分别表现为溶原性和裂解性。此外,这两个噬菌体还有一个非常重要的区别,γ噬菌体具有一个1360bp的抗生素(磷霉素)抗性基因。

本研究的目的是改造制备具有luxAB标签的重组噬菌体,并利用该噬菌体进行炭疽芽孢杆菌的检测实验。为了有助于进行遗传操作和克隆重组噬菌体,选择了γ噬菌体的父代,Wß噬菌体进行研究。

一、噬菌体的诱导、分离和增殖

利用蜡样芽孢杆菌(B. cereus)ATCC 11950株(含有Wß溶原性噬菌体)诱导Wß溶原性噬菌体,增殖纯化噬菌体。

1、接种ATCC 11950单菌落到2ml BHI培养基,37℃培养16h。

2、细菌培养液涂BHI琼脂平板,并分别加入磷霉素钠盐(phosphomycin disodium salt)至终浓度为20、30和40μg/ml,37℃培养17-20h。

3、挑取中间透明区再划线接种于BHI磷霉素平板,37℃培养过夜后会形成特征性的油炸圈形菌落(donut-shaped colonies)。

4、挑取中间透明区,与SM液混匀,0.22μm滤膜过滤除菌。

5、噬菌体单斑用蜡样芽孢杆菌ATCC4342扩增培养后,保存于SM缓冲液。

二、构建luxAB表达盒

利用PCR从pQF110(ATCC77113)扩增到哈氏弧菌(Vibrio harveyi)的luxA和luxB基因,定向克隆到pBluescript-SK– (Stratagene),启动子pro2被克隆到luxAB基因上游,转录终止子TL17被克隆到下游,从而构建出luxAB表达盒。表达盒两端有酶切位点,有利于亚克隆到大肠杆菌/芽孢杆菌穿梭质粒pHP13。

三、同源重组用载体的构建

从Wß噬菌体扩增一个374 bp的片段(包括Wß噬菌体阅读框wp39⁄wp40及其之间的序列和wp40的5’端序列)作为同源重组盒的5’端序列(序列见33 312–33 686位,GenBank accession number DQ289555)。一个383 bp的wp41区域片段(位于Wß基因组的35 948–36 331 bp位5)作为同源重组盒的3’端序列。这两个片段克隆到luxAB表达盒两端,并加入抗性筛选标记Spc基因。

四、同源重组筛选Wß::luxAB

将构建的同源重组载体电转化到含Wß噬菌体的蜡样芽孢杆菌ATCC4342溶原菌,用含Spc的平板培养基筛选电转化后的重组菌株(重组菌株具有生物发光特性)。重组菌株接种于含Spc的液体BHI培养基,30℃培养18h。筛选发生了同源重组的Wß::luxAB噬菌体,以用于建立炭疽芽孢杆菌的快速检测系统。

参考文献:

Schofield DA, Westwater C. Phage-mediated bioluminescent detection of Bacillus anthracis. J Appl Microbiol. 2009,107(5): 1468-1478.

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