利用生物发光报告(lux)噬菌体建立出血性大肠杆菌O157:H7快速检测技术

摘 要:

建立食品或饮水中病原菌的快速检测技术对于预防食源性病原菌感染非常关键。以lux为报告基因,利用出血性大肠杆菌O157:H7裂解性噬菌体,建立O157:H7快速检测技术。重组噬菌体对纯培养物的检测敏感性达到10 CFU/ml,对人工污染的苹果汁,检测敏感性为10E4 CFU/ml。

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PP01噬菌体是由Morita等从猪粪便中分离到的裂解性噬菌体[1],对O157:H7菌株具有型特异性。Oda等[2]建立了利用GFP报告噬菌体快速检测EHEC O157的方法,GFP报告基因被整合到PP01噬菌体。PP01-GFP报告噬菌体检测方法具有快速、特异等优点,但与其它基于GFP的检测方法一样,需要高能光源来激发GFP(即需要荧光显微镜),这限制了该方法的实际应用。

Brigati等[3]利用lux作为报告基因建立噬菌体检测技术。利用luxI-luxR基因编码群感应系统,首先将luxCDABE操纵子和转录调节基因luxR克隆到生物报告细菌,然后将luxI基因整合到噬菌体,利用重组噬菌体感染靶细菌后产生的扩散性分子OHHL使生物报告细菌发光。

一、重组报告噬菌体PP01-luxI的构建方法

重组报告噬菌体的构建方法与Oda等[2]构建PP01-GFP的方法相同。构建携带luxI基因(GenBank accession no. Y00509)的重组质粒,在luxI基因上下游分别加入启动子和终止子,再在两端分别克隆入噬菌体的同源序列。

重组质粒电转化入大肠杆菌O157:H7(ATCC 43888),重组菌株培养至对数生长期,加入感染复数为0.01和0.1的PP01噬菌体,37℃培养5h,以便噬菌体和质粒发生同源重组。加入氯仿裂解细菌,37℃再培养15min。离心去除细菌碎片。

用斑点杂交实验筛选重组噬菌体(Alkphos Direct Labeling and Detection System,Amersham Biosciences)。阳性重组噬菌体扩大培养,用于后续检测实验。

二、重组噬菌体PP01-luxI检测大肠杆菌O157:H7纯培养物

1、重组噬菌体PP01-luxI用SM稀释到10E8 PFU/ml;报告大肠杆菌OHHLux于28℃培养到OD600值为0.35(约10E8 CFU/ml)。

2、大肠杆菌O157:H7菌株(ATCC 43888、ATCC 43889、ATCC 43894、ATCC 43895和ATCC 700927)在LB中于37℃培养至OD600值为0.2(约10E8 CFU/ml)。然后10倍系列稀释至最低10 CFU/ml。

3、稀释后菌液加入到96孔板,每孔100μl。然后加入PP01-luxI噬菌体,每孔100μl(约10E7 PFU/孔)。并加入报告大肠杆菌OHHLux(50μl/孔,约2*10E7 CFU/孔)。

4、96孔板用透气膜密封,30℃培养22h,每隔1h监测生物发光

5、为了增加检测敏感性。将各系列O157稀释液于37℃振荡培养3h进行预培养,然后按上述方法进行检测。

结果:对于纯培养物,10E4—10E8 CFU/ml浓度,无需预孵育,1h内可得到检测结果;如果进行3h预孵育,可在4h内检测到初始浓度为10 CFU/ml的纯培养物。

三、重组噬菌体PP01-luxI检测人工污染苹果汁中的大肠杆菌O157:H7

1、重组噬菌体PP01-luxI用SM稀释到10E8 PFU/ml;报告大肠杆菌OHHLux于28℃培养到OD600值为0.35(约10E8 CFU/ml)。

2、大肠杆菌O157:H7菌株(ATCC 43888在LB中于37℃培养至OD600值为0.2(约10E8 CFU/ml),离心。菌体用原始体积市售巴斯德灭菌的苹果汁重悬。

3、用苹果汁进行10倍系列稀释至最低1 CFU/ml。

4、取0.5ml人工污染的苹果汁加入3ml LB在40℃预培养1-6h。

5、取100μl培养液,按纯培养检测方法进行检测。

结果:预实验表明,如果苹果汁不预先稀释,即使含有高浓度的细菌也检测不到发光。因此对苹果汁进行了稀释(0.5ml人工污染的苹果汁加入3ml LB)。对于10E8 CFU/ml浓度的苹果汁,总时间为预孵育1h+检测时间1.5h;10E4 CFU/ml浓度的苹果汁,总时间为预孵育6h+检测时间1.5h;低于10E4 CFU/ml浓度的苹果汁则检测不出。

参考文献:

[1] Morita M, Fischer CR, Mizoguchi K, et al. Amino acid alterations in Gp38 of host range mutants of PP01 and evidence for their infection of an ompC null mutant of Escherichia coli O157:H7. FEMS Microbiol. Lett. 2002,216:243–248.

[2] Oda M, Morita M, Unno H, et al. Rapid detection of Escherichia coli O157:H7 by using green fluorescent protein–labeled PP01 bacteriophage. Appl. Environ. Microbiol. 2004,70:527–534.

[3] Brigati JR, Ripp SA, Johnson CM, et al. Bacteriophage-based bioluminescent bioreporter for the detection ofEscherichia coli 0157:H7. J Food Prot. 2007,70(6):1386-92.

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  1. avatar Emily

    不错,学习了。
    不过好象对于污染样品的检测敏感性并不太高。

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