用报告基因(绿色荧光蛋白基因gfp)标记的重组噬菌体检测出血性大肠杆菌O157:H7

摘 要:

噬菌体对靶细菌具有非常高的特异性和敏感性,可以利用噬菌体的这种特性,对其进行标记后用于检测细菌。对噬菌体基因组的改造方法主要是通过同源重组,将外源基因整合到噬菌体基因组的非必需区。如Oda等利用绿色荧光蛋白基因gfp对出血性大肠杆菌的裂解性噬菌体PP01进行标记,然后用重组噬菌体检测出血性大肠杆菌O157:H7。

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噬菌体对靶细菌具有非常高的特异性和敏感性,因此,可以利用噬菌体的这种特性,对噬菌体进行标记后用于检测某类细菌。如Oda等利用绿色荧光蛋白基因gfp作为报告基因,对出血性大肠杆菌O157:H7的裂解性噬菌体PP01进行标记,然后用重组噬菌体检测出血性大肠杆菌O157:H7。

目前对噬菌体基因组进行改造的方法主要是通过同源重组,将外源基因整合到噬菌体基因组的非必需区,然后筛选重组噬菌体。由于PP01噬菌体属于裂解性噬菌体,对这类噬菌体进行同源重组和筛选的难度都比较大。下面是Oda等的论文中对裂解性噬菌体PP01的改造方法:

一、测定噬菌体基因组,通过生物信息学或其它方法,分析噬菌体基因组的非必需区。

二、确定噬菌体基因组同源重组的位置,PCR扩增上下游序列,并在中间克隆入报告基因gfp。

三、将报告基因同源重组到噬菌体基因组的方法

1、将重组质粒电转化入出血性大肠杆菌O157:H7 (ATCC 43888);

2、转化后的重组菌在LB中培养(Amp)到OD600值为0.1时,加入噬菌体PP01至感染复数(MOI)为0.01;

3、继续培养5h后,加入氯仿,裂解细菌,离心除去细菌碎片;

4、用SM稀释裂解液至噬菌体浓度为10E4 PFU/ml;

5、稀释后的噬菌体裂解液与出血性大肠杆菌O157:H7混匀,与0.7%的LB琼脂混合,涂平板;

下面步骤是用地高辛(DIG)标记的探针通过DNA杂交方法检测筛选重组噬菌体。

6、噬菌斑被转移到尼龙膜,浸入变性缓冲液中5min,中和缓冲液15min,2倍SSC液10min;

7、噬菌体DNA交联在膜上,在蛋白酶K溶液(2mg/L)中37℃孵育1h;

8、膜用去离子水清洗后,与DIG-Easy-Hyb buffer (Roche Diagnostic)在55℃预杂交1h;

9、膜与地高辛(DIG)标记的gfp探针在55℃杂交过夜;

探针DNA是用DIG标记探针合成试剂盒(DIG-Probe-Synthesis kit,Roche Diagnostic)通过PCR扩增得到。

10、在室温下,杂交膜用2倍SSC(含0.1% SDS)清洗2次,每次5min;

11、在68℃,杂交膜用0.1倍SSC(含0.1% SDS)清洗1次15min;

12、用DIG发光检测试剂盒(DIG-Luminescent-Detection kit,Roche Diagnostic)检测杂交斑;

13、分离杂交显色的噬菌斑并纯化2次,通过PCR和测序等方法确认目的基因整合进了噬菌体基因组。

14、将重组噬菌体以感染复数为0.01的量加入250ml出血性大肠杆菌O157:H7培养液,培养6h。加入2.5ml氯仿,然后在4℃再培养1h,按常规方法分离纯化重组噬菌体。

四、用gfp基因标记的重组噬菌体检测出血性大肠杆菌O157:H7

1、对数生长期的大肠杆菌O157:H7培养液(10E7 CFU/ml)冰浴,待用;

2、细菌培养液于25°C放置10min预升温,与等量的噬菌体溶液(5×10E9 PFU/ml)混匀,25°C放置10min;

3、离心,沉淀用PBS洗1次,并用PBS重悬沉淀;

4、GFP标记的重组噬菌体吸附在大肠杆菌O157:H7,在荧光显微镜下能观察到发光的细菌。

参考文献:

Oda M, Morita M, Unno H, et al. Rapid detection of Escherichia coli O157:H7 by using green fluorescentprotein-labeled PP01 bacteriophage. Appl Environ Microbiol. 2004,70(1):527-34.

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