利用含发光基因的重组噬菌体建立特异敏感快速的沙门氏菌检测技术

摘 要:

噬菌体感染宿主菌具有高度的敏感性和特异性,利用噬菌体携带外源标记基因进入靶细菌建立快速、特异、敏感的检测方法具有可行性。以沙门氏菌裂解性噬菌体Felix01(即F01)为始发噬菌体,筛选发生了双重琥珀型无义突变的噬菌体,并利用同源重组整合入荧光素酶(luciferase)基因luxA和luxB。利用重组噬菌体建立特异敏感快速的沙门氏菌检测技术。

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科学家们一直在努力建立快速、特异、敏感的食品病原菌检测方法。传统的细菌分离鉴定技术耗时耗力,不能适应实际需要。随着分子生物学的发展,人们建立了一些新型检测技术,如标记抗体、PCR、核酸杂交等技术。标记抗体检测技术的敏感性受到限制,PCR和核酸杂交等方法不能区分样品中的活菌和死菌。

噬菌体能够感染宿主菌,这种感染具有很高的敏感性和特异性。利用噬菌体携带外源标记基因进入靶细菌,从而建立快速、特异、敏感的检测方法具有可行性。噬菌体感染宿主菌后有两种类型,一类是裂解性噬菌体,噬菌体在靶细菌中复制后,裂解靶细菌,释放出子代噬菌体;另一类是溶原性噬菌体,噬菌体基因组进入靶细菌后,成为靶细菌的一部分,不裂解细菌,与细菌一起复制。通常溶原性噬菌体更容易通过遗传操作进行改造。

建立基于噬菌体的快速检测技术,选择合适的噬菌体进行改造是至关重要的一步。噬菌体对要检测的靶细菌要具有广谱的特异性。同时,噬菌体对靶细菌的吸附敏感性也很重要,在理想状态下,敏感性应达到检测少于50CFU/ml的细菌。此外,噬菌体的基因组最好是双链DNA,以便于对噬菌体进行遗传改造。

利用转座方法构建并筛选重组溶原性噬菌体比较容易,但利用这种方法构建并筛选重组裂解性噬菌体就困难得多,因为噬菌体-宿主菌共存的时间很短暂。利用抗生素筛选标记进行筛选也比较困难,因为细菌在具有抗性和细菌裂解之间的时间窗口非常短暂。利用噬菌体琥珀突变的无义抑制子作为筛选标记可能是更简单的方法。

Felix 01(也叫F01)是检测沙门氏菌非常理想的一个噬菌体,这是1943年由Felix和Callow分离的一个沙门氏菌裂解性噬菌体,对沙门氏菌具有很高的裂解效率。首先筛选发生了双重琥珀无义突变的噬菌体,然后通过同源重组方法整合入荧光素酶(luciferase)基因luxA和luxB。利用重组噬菌体可以建立沙门氏菌检测技术。

参考文献:

Kuhn J, Suissa M, Wyse J, et al. Detection of bacteria using foreign DNA: the development of abacteriophage reagent for Salmonella. Int J Food Microbiol. 2002,74(3):229-238.

    日期:2014年03月31日  分类:噬菌体
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