末端限制性片段长度多态性的原理和方法

摘 要:

末端限制性片段长度多态性分析是限制性片段长度多态性技术(RFL P) 的扩展,是以荧光标记引物PCR为基础,根据末端限制性片段长度分析微生物群体组成的一种微生物群体图谱法。它的基础原理涉及末端荧光标记的PCR产物的限制性酶切。T-RFLP具有快速、重复性高、灵敏、高通量等优点。

关键词:

末端限制性片段长度多态性(Terminal-restriction fragment length polymorphism,T-RFLP)分析是限制性片段长度多态性技术(RFL P) 的扩展,是以荧光标记引物PCR为基础,根据末端限制性片段长度分析微生物群体组成的一种微生物群体图谱法。它的基础原理涉及末端荧光标记的PCR产物的限制性酶切。T-RFLP具有快速、重复性高、灵敏、高通量等优点。

T-RFLP可以对一个生物群体的特定基因进行定性和定量测定。16S rRNA基因片段通常作为靶序列,可通过非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳和毛细管电泳分离,然后用激光诱导的荧光鉴定。此技术的优点是可以检测微生物群落中较少的种群。另外,系统发生分类也可以通过末端片段的大小推断出来。T-RFLP技术的局限包括假末端限制性片段的形成,它可能导致对微生物多样性的过多估计。引物和限制酶的选择对于准确评估生物多样性也很重要。

T-RFLP依据微生物的比较基因组学信息,选取一段具有系统进化标记特征的DNA序列(通常选取16S rRNA基因片段)为靶序列设计引物,用荧光物质标记出1个或2个引物的5’端(2个引物同时标记时,要用不同的荧光物质标记) 。扩增后的PCR产物用四碱基限制性内切酶进行消化,荧光标记末端片段可被测序仪识别,得到不同的末端片段峰,每一个峰就可至少代表一种类型的微生物,通常用系统分类操作单元(OTU)来表示。故根据片段峰的大小和数量可以检测和分析环境样品中微生物的末端限制性片段图谱,进而可分析出微生物群体的组成和动态变化等生态信息。

参考文献:

李献梅, 王小芬, 崔宗均. 末端限制性片段长度多态性技术( T-RFLP)在微生物群体分析上的应用与技术优化. 中国农业大学学报, 2009,14 (4) :1-9.

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