细菌生物膜(菌膜)的培养与观察检测方法

摘 要:

细菌生物膜(Bacterial biofilm,BF)也称为菌膜,随着显微镜技术和分子生物学技术的发展,人们对菌膜的研究也越来越系统。菌膜的培养可分为静止培养和动态培养两种,在评价细菌形成菌膜的能力时,常需要这两种方法的结合运用,以便最大限度的模拟细菌形成菌膜的实际生长环境。目前,检测菌膜的常用方法主要有三种:96孔酶标板结晶紫法、显微镜观察法和直接观测法。

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细菌生物膜(Bacterial biofilm,BF)也称为菌膜,是于19世纪20年代由Angst观察船体表面上海洋细菌时提出[1]。1966年,Duguid等对沙门氏菌粘附特性的报道开创了食源性病原菌生物膜的研究[2]。之后,关于其它食源性病原菌粘附及其菌膜形成机理的报道日益增多。1988年,Herald报道了单核细胞增生李斯特菌在不同温度下对不锈钢表面的粘附特性,翻开了对该菌菌膜研究的篇章。现在随着显微镜技术和分子生物学技术的发展,人们对菌膜的研究也越来越系统化。

菌膜培养与观察方法

菌膜的培养可分为两种,一种为静止培养,一种为动态培养。静止培养是指在选定的特定吸附材料表面上对细菌进行常规的静止培养,以使细菌在静止的环境中粘附于固相介质表面形成菌膜。动态培养可以为细菌提供一个动态的生长环境,在动态环境下观察细菌在固相介质表面形成菌膜的情况。现在评价菌膜的形成能力,多需要这两种方法的综合运用,以便最大限度的模拟细菌形成菌膜的实际生长环境,得到不同生长状态下菌膜的形成情况。例如,Rieu等用这两种方法观察菌膜的形成,就发现静止条件下菌膜的形成比流式培养条件下要少[3]。另外,还经常要用到活细胞(例如HT-29上皮细胞)来观察细菌在生物材料上形成菌膜的情况。

现在已有许多方法应用于菌膜检测的研究中,如超声平板计数、同位素标记技术、菌膜染色、直接培养方法等。虽然运用这些方法可以直接或间接的估算菌膜的生物量,但也存在不足,如超声波等方法不能完全振荡下细菌,平板计数方法不够精确,所以这些类似的先使菌膜浮游开来的方法无法进行菌膜的定量研究。直接观察菌膜的方法现在主要有荧光显微镜、激光共聚焦扫描显微镜(CSLM)、透射及扫描电镜等。因为许多多糖也能够被染料染色而发出荧光,所以荧光显微镜也无法很精确的计算菌膜当中的细菌数,但它却是一种确定细菌是否粘附到固体表面上的非常有用的方法。另外,在确定如超声波等理化方法去除菌膜的效果时,用显微镜观察还能很直接确定菌膜的残留情况。目前,常用的菌膜测量方法主要有以下三种。

1、96孔酶标板结晶紫法

该法用于观察静置培养的细菌菌膜,操作简单、成本低廉,是目前测量菌膜生成量最常用的方法。Djordjevic等对31株单核细胞增生李斯特菌在含有特定培养基的PVC微孔板中进行培养后,用1%的结晶紫染色,然后用乙酸进行脱色,通过测量洗脱结晶紫后脱色液的OD值来直接确定菌膜的形成量。该方法的具体操作步骤请参考:http://www.bacteria.cn/html/2014/935.html

2、显微镜观察法

用荧光显微镜、激光共聚焦扫描显微镜、透射及扫描电镜观察在气液交接处或特定材料上由细菌形成的明显膜状菌膜的情况的方法。细菌单纯的粘附并不等于形成菌膜,只有细菌包被于自身的胞外多糖等物质中的状态才算具有菌膜的特征。因此单纯依靠96孔酶标板结晶紫法只能鉴定细菌的粘附情况,还需要通过荧光染色等方法来观察多糖物质等的生成才能判断菌膜的形成情况。

3、直接观测法

漂浮的菌膜或薄膜(pellicles),是在培养基的气液交界面形成的另一种有典型特征的菌膜。由于缺少固相介质,细菌一开始生长时便会对自身组织有更多地需求,并且由于暴露于空气中的界面缺少强气流的冲击使得形成的菌膜结构更加复杂。此外,结构形态和细胞产胞外基质的能力这两者之间有明显的关系,菌落观察在形态学上的应用也很广泛。

参考文献:

[1] Bagge N, Schuster M, Hentzer M, et al. Pseudomonas aeruginosa biofilms exposed to imipenem exhibit changes in global gene expression and beta-lactamase and alginate production. Antimicrob Agents Chemother. 2004, 48(4): 1175-1187.

[2] Stoodley P, Debeer D, Lewandowski Z. Liquid flow in biofilm systems. Appl Environ Microbiol. 1994, 60(8): 2711-2716.

[3] Kaplan JB, Ragunath C, Velliyagounde, K, et. al.. Enzymatic detachment of Staphylococcus epidermidis biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 2004, 48(7): 2633-2636.

    日期:2014年03月23日  分类:病原菌
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