大肠杆菌特异性裂解噬菌体的分离纯化实验方法

摘 要:

噬菌体是特异性感染裂解细菌的一种特殊病毒,必须在宿主菌内才能繁殖。在自然界中,噬菌体是伴随着宿主菌的分布而分布,凡有细菌分布的地方,均可发现其特异的噬菌体存在。例如粪便与阴沟污水中含有大量大肠杆菌,故也能很容易地分离到大肠杆菌噬菌体;乳牛场有较多的乳酸杆菌,相应也容易分离到乳酸杆菌噬菌体等。本文以大肠杆菌为例,介绍从污水中分离大肠杆菌裂解性噬菌体的分离方法。

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噬菌体是特异性感染裂解细菌的一种特殊病毒,必须在宿主菌内才能繁殖。在自然界中,噬菌体是伴随着宿主菌的分布而分布,凡有细菌分布的地方,均可发现其特异的噬菌体存在。例如粪便与阴沟污水中含有大量大肠杆菌,故也能很容易地分离到大肠杆菌噬菌体;乳牛场有较多的乳酸杆菌,相应也容易分离到乳酸杆菌噬菌体等。

大肠杆菌特异性裂解噬菌体的分离纯化实验方法

噬菌体

 

下面以大肠杆菌为例,介绍从污水中分离大肠杆菌裂解性噬菌体的分离方法:

1、用瓶子采集10份不同环境中的污水样品。

2、将采集的10份污水样品分别取85ml,加入50ml三倍浓缩的液体LB培养基和15ml宿主菌的过夜培养菌液,置37℃振荡培养过夜。将过夜培养液以6000 rpm离心15min,弃沉淀,上清液用经0.2μm微孔滤膜过滤,滤液即为噬菌体原液。

3、将下层培养基(液体LB培养基+1.5%琼脂粉)倒平板(作为底层营养琼脂),凝固后将平板放置于37℃保温备用。

4、吸取100μl噬菌体原液与100μl宿主菌过夜培养菌液混匀,37℃孵育20min。

5、将100ml上层培养基(即半固体培养基:液体LB培养基+0.7%琼脂粉)融化后,于45℃水浴保温备用。

6、将步骤4孵育后的混合液加入已融化好45℃保温的上层培养基中,充分混匀,迅速倒入步骤3准备好的下层培养基上,旋转平皿使其分布均匀,待其凝固后,37℃倒置培养后,观察有无噬菌斑。

7、如果滤液中没有特异性噬菌体,则不形成噬菌斑;如有噬菌体存在,则可在平板上形成噬菌斑。

8、用枪头挑取直径较大的噬菌斑,置于500μl SM保存液中,4°C放置3h。

9、用0.2μm微孔滤膜过滤,用SM保存液将滤液作10倍梯度稀释。

10、用稀释液按照双层平板法实验,涂板作单斑培养。

11、用5ml LB管将宿主菌培养至对数生长早期。

12、从平板挑直径较大的单个噬菌斑接种于1ml培养好的宿主菌液,37°C培养6h增殖。

13、再用双层平板法观察噬斑的形态,重复操作3~5次。目的是得到形状和大小一致的噬菌斑。

附注说明:

1、SM保存液:NaCl 5.8g,MgSO4·7H2O 2g,1M Tris·CL(PH7.5)50ml,2%明胶5ml,加双蒸水至1000ml,121°C高压灭菌20min,4°C保存。该溶液用于噬菌体的保存及稀释。

2、第1-7步是分离裂解性噬菌体。通常刚分离出的噬菌体常不纯,如在平板上形成的噬菌斑形态、大小不一致等,需要作进一步纯化。

3、第8-13步是进行噬菌体的纯化,经过3-5轮的挑单噬菌斑培养增殖,最后在平板上可得到形态大小一致的噬菌斑。

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