转基因动物的制备方法:显微注射法、病毒载体法和体细胞核移植

摘 要:

转基因动物技术是利用基因工程技术将外源目的基因整合到受体动物基因组中,实现目的基因在动物体内稳定表达和遗传的技术。转基因动物技术使人们实现了对动物基因组进行有目的性、计划性和可预见性的遗传改造。可以利用基因插入、基因敲除、基因点突变修饰和多基因协同遗传修饰等方法对动物基因组进行遗传操作。转基因动物制作方法主要有三种:显微注射法、病毒载体法、体细胞核移植。

关键词:

转基因动物技术是利用基因工程技术将外源目的基因整合到受体动物基因组中,实现目的基因在动物体内稳定表达和遗传的技术。转基因动物技术使人们实现了对动物基因组进行有目的性、计划性和可预见性的遗传改造。基因重组技术经过数十年的快速发展,目前人们已经可以对动物基因组进行多种遗传操作,如基因插入(knock-in)、基因敲除(knock-out)、基因点突变修饰和多基因协同遗传修饰,从而使得转基因动物的应用越来越广。

1971年,Brackett等将SV40病毒DNA与家兔精子共孵育,然后将该精子与卵子体外受精,产生了世界上第一只转基因兔子。1983年,Palmite等利用原核显微注射法把大鼠的生长激素基因注射到小鼠受精卵中,成功产生了轰动一时的体型巨大的“超级小鼠”。超级小鼠的出现,使人们认识到转基因技术在农业和医学领域有巨大的应用潜力。而将体细胞克隆技术与基因工程相结合,使高效制备转基因家畜动物成为可能。目前,转基因克隆技术已被应用于构建动物生物反应器、人类异种器官移植、优良家畜新品种培育和人类疾病模型构建等领域。

转基因动物制作方法主要有三种:

1、显微注射法

显微注射法是利用显微操作系统将外源基因注入受精卵原核中,使外源基因随机整合到受体细胞染色体组中,再通过胚胎移植技术将转基因胚胎移植到代孕受体动物子宫中,经过体内发育获得转基因动物。

利用显微注射制备转基因小鼠等小动物中具有操作性强,可导入大片段基因(可达到250kb),较少产生嵌合体等特点。目前,已通过该技术获得了转基因小鼠、兔、绵羊、猪、牛、鱼和鸡等各种转基因动物。然而该方法有一些缺点使其很难在大动物中广泛应用:

(1) 显微操作仪器昂贵;

(2) 技术操作复杂,要求经过专门训练的技术人员操作仪器;

(3) 显微注射导入的外源基因在基因组中随机整合,可能导致内源性功能基因突变或者激活一些致癌基因,无法调控外源基因在基因组中的整合数目(拷贝数);

(4) 外源基因整合效率较低,构建转基因大动物成本较高;

(5) 只能实现目的基因的整合,不能进行基因敲除研究。

尽管如此,在体细胞核移植技术出现前,显微注射法是被广泛使用和效果最好的转基因技术。

2、病毒载体法

逆转录病毒感染法是最早被用于制备转基因动物的方法。常用的病毒载体包括逆转录病毒载体和慢病毒载体。该方法首先将目的基因片段克隆至病毒载体的长末端重复序列(long terminal repeat, LTR)的下游,利用病毒系统将含有目的基因的载体包装成高滴度的病毒颗粒,以该病毒颗粒侵染动物受精卵或者胚胎,在病毒的介导下实现目的基因整合到动物基因组中。1987年,Salter等以鸡白血病病毒作为转基因载体成功制备了转基因鸡。1998年,Chan等将逆转录病毒载体注射到牛的卵母细胞中,与精子共同孵育使其受精,在体外培养,使其发育到囊胚期,将其植入受体母牛的子宫内,产下4头健康犊牛。

逆转录病毒载体具有感染宿主较窄,产生嵌合体动物的概率高等缺点,限制了其在转基因动物制备中的应用。随着病毒载体的发展,目前慢病毒载体逐渐成为病毒载体法的主导方法。

与一般的逆转录病毒载体法相比,慢病毒载体法具有感染宿主范围广,可感染几乎所有类型的细胞(分裂细胞和非分裂细胞),一般对细胞的感染力可达90%以上,具有较强的基因组整合能力。外源基因整合进入基因组织,可以稳定遗传。2010年,刘明军等利用慢病毒载体法制备转基因绵羊,对新生的162只羔羊进行检测,发现其中92只为转基因羔羊,平均转基因效率高达56.8%,显示出慢病毒法高效制备转基因动物的优势。但是慢病毒还有一些缺点,有待进一步改进。如慢病毒载体自身有潜在的致癌性,安全性有待提高,病毒载体容量不够大,目前只能插入小于10kb的外源基因。

3、体细胞核移植

1986年,Willadsen等利用电融合和仙台病毒诱导细胞融合的方法,利用卵裂球来源的细胞核进行核移植,成功制备出两只克隆绵羊。在这之后,研究者们一直尝试利用完全分化的成年动物的体细胞克隆动物。Wilmut等报道利用成年绵羊的乳腺上皮细胞为供体细胞,通过细胞核移植成功克隆出转基因绵羊,标志着哺乳动物体细胞克隆技术进入了新的时期。利用Wilmut建立的体细胞核移植技术路线,目前,已经以多种体细胞成功制备了绵羊、小鼠、兔、山羊、猪、牛、狗、马和大鼠等哺乳动物。

在制备转基因动物方面,体细胞核移植技术与传统的显微注射法相比具有更多优点。显微注射获得的动物个体为嵌合体,需要后续进行筛选。而体细胞核移植获得的转基因动物,在核移植之前供体细胞可以进行筛选,将鉴定为阳性的体细胞再用作核供体,这样获得克隆动物几乎都是转基因动物。另外,作为核供体的细胞可以具有明显的选择性,我们可以选择品种优良的个体建立细胞系,再进行转基因动物的制备,使获得转基因个体具有更优良的性状。但是,体细胞核移植技术也存在着一些问题:

(1) 克隆动物的成功率及存活率较低;

(2) 部分个体表现出生理或免疫缺陷;

(3) 体细胞重编程机制不清及核移植条件尚需优化。

    日期:2014年03月14日  分类:其 它
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