免疫组化实验中加热抗原修复的方法

常用的抗原修复方法可分为化学方法和物理方法。其中,化学修复方法是以酶消化方法,物理修复方法主要是热诱导的抗原决定簇修复(Heat Induced Epitope Retrieval,HIER)方法,包括单纯加热、微波处理和高压加热等。在选用这几种加热法时,浸泡切片的缓冲液的离子强度和PH值、加热的温度和时间等均会影响抗原修复效果。

HIER法尤其对核抗原的修复作用更加明显,最常用的抗原修复液是pH6.0的枸橼酸缓冲液和pH8.0的EDTA缓冲液,它们的作用原理是通过钠离子的螯合而实现的。

抗原修复液的pH值非常重要,某些情况下,甚至比比修复液的化学成分更重要,同样的修复液随着pH值的升高染色的强度逐渐增强,但最佳pH值范围为6.0~10.0,对于大多数抗原这个范围的pH值都能进行有效的修复,有些抗体(如Ki-67、ER)则在pH值l.0~3.0和6.0~8.0更为有效。作为通用修复液碱性pH值的修复液要比酸性的有效,而对固定很长时间旧的存档组织,酸性pH值的修复液则优于碱性的修复液,所以两种抗原修复液可作为相互替补的进行抗原修复。

在进行HIER过程中应防止切片的干燥,加热时必须达到规定的温度,保温时间要足够,对于一些不要抗原修复的抗体最好不要采用HIER处理,否则对染色无益,但有些抗体则需要利用多种修复联合应用。

HIER方法主要有三种:

1、水浴加热法

将切片放入装有修复液的容器中,连容器一起放入水浴锅中,当修复液温度达到95℃左右时计时l5min,自然冷却至室温后,PBS洗3min×3次,然后按选好的免疫组织化学的染色方法进行染色。

水浴加热法应用隔水热方法,需要较长时间的热的作用,如果达不到应有时间,效果将不理想。

2、微波加热法

将切片放入修复液中微波加热使温度在96℃左右,计时l0min(如检测Er和Pr则需要20min),在微波炉中停留2min,室温自然冷却,PBS洗3min×3次,然后按选好的免疫组织化学的染色方法进行染色。

微波加热法是利用微波每秒以24亿5千万次的快速运动产生瞬间热。当然,光靠微波的作用是不够的,还必须依靠热的作用。应用微波辐射,它有双重作用,微波辐射可以使各物质分子作极性运动。促进形成的醛键断裂开。分子间运动所产生的瞬间热,当达到有效的温度后,就可导致甲醛固定后的蛋白的变性。该法的特点是:产热迅速,容易操作,也容易引起抗原修复液的沸腾,使用微波炉时禁止使用金属性的器皿,以防引起失火或爆炸。

3、高压加热法

将切片放入抗原修复液中(要使修复液淹没切片),与容器一同放入高压锅中加热,开始喷气时盖上压力阀。计时2min。冷水冲至室温取出切片,PBS洗3min×3次。然后按选好的免疫组织化学染色方法进行染色。

该法利用高压和高热来促进醛键的断裂,当加热至开锅,加上高压阀后,汽体喷出,此时的温度已达121℃左右。该法被应用于一些较难修复的抗原,经大量实验表明,该法效果不错。

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