免疫组化实验中抗原修复的方法

经甲醛固定的部分组织细胞,可使免疫组化标记敏感性明显降低,这是因为在甲醛固定过程中,组织中的许多氨基酸残基在分子内或分子间形成了醛键,使得不少抗原决定簇被封闭。此外,由于甲醛的聚合作用,使蛋白质分子间相互交联形成大分子网络,也导致了抗原决定簇被掩盖,这就使得相当部分的抗原不能与抗体很好的进行反应。因此,在染色时,有些抗原需先进行修复或暴露。

抗原修复方法可分为化学方法和物理方法。化学方法是以酶消化方法,常用胰蛋白酶及胃蛋白酶,配制浓度与消化时间要适度。常用的物理方法有单纯加热、微波处理和高压加热。在选用这三种加热法时,浸泡切片的缓冲液的离子强度和PH值、加热的温度和时间等均会影响抗原修复效果。目前最常用的修复方法有如下几种:

1、胰蛋白酶(Trpsin)法

主要用于细胞内抗原的修复。一般使用浓度为0.1%,37℃作用10min。

配法:0.1g胰蛋白酶加入到0.1% pH7.8 CaCl2(无水)水溶液中溶解后即可。

2、胃蛋白酶(Pepsin)法

主要用于细胞间质或基底膜抗原的修复。一般浓度为0.4%,37℃作用30min。

配法:0.4g胃蛋白酶溶于0.lmol/L HCl水溶液中。

3、热诱导的抗原决定簇修复(Heat Induced Epitope Retrieval,HIER)方法

HIER法尤其对核抗原的修复作用更加明显,最常用的抗原修复液是pH6.0的枸橼酸缓冲液和pH8.0的EDTA缓冲液,它们的作用原理是通过钠离子的螯合而实现的。

抗原修复液的pH值非常重要,有效的抗原修复pH值要比修复液的化学成分更重要,同样的修复液随着pH值的升高染色的强度逐渐增强,但最佳pH值范围为6.0~10.0,对于大多数抗原这个范围的pH值都能进行有效的修复,有些抗体(如Ki-67、ER)则在pH值l.0~3.0和6.0~8.0更为有效。作为通用修复液碱性pH值的修复液要比酸性的有效,而对固定很长时间旧的存档组织,酸性pH值的修复液则优于碱性的修复液,所以两种抗原修复液可作为相互替补的进行抗原修复。在进行HIER过程中应防止切片的干燥,加热时必须达到规定的温度,保温时间要足够,对于一些不要抗原修复的抗体最好不要采用HIER处理,否则对染色无益,但有些抗体则需要利用多种修复联合应用。

HIER方法有:

1)水浴加热法

将切片放入装有修复液的容器中,连容器一起放入水浴锅中,当修复液温度达到95℃左右时计时l5min,自然冷却至室温后,PBS洗3min×3次。

2)微波加热法

将切片放入修复液中微波加热使温度在96℃左右,计时l0min,在微波炉中停留2min,室温自然冷却,PBS洗3min×3次。

3)高压加热法

将修复液在高压锅中煮沸,切片插在染色架上,放入锅中(要使修复液淹没切片)开始喷气时盖上压力阀。计时2min,冷水冲至室温取出切片,PBS洗3min×3次。

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