酶免疫组化S-P三步法染色操作步骤

摘 要:

酶免疫组化S-P法(链霉卵白素-过氧化物酶连结法)具有灵敏度高,操作简便,价格较低等特点,但容易出现背景染色。S-P三步法染色的主要步骤包括:石蜡切片脱蜡和水化、细胞通透、封闭并阻断内源性过氧化物酶的活性、抗原修复暴露抗原决定族、封闭非特异性蛋白、一抗孵育、二抗孵育、SP反应、复染、脱水、透明、封片等。

关键词: ,

S-P法(链霉卵白素-过氧化物酶连结法)是20世纪90年代出现的检测系统,其灵敏度高,操作简便,价格较低,但容易出现背景染色。S-P三步法染色具体操作步骤如下:

1、石蜡切片脱蜡和水化

1) 60 °C×20 min → Xylene 2 ×10 minutes;

2) 100% absolute ethanol:2 ×5 minutes;

3) 95% ethanol:2 minutes;

4) 80% ethanol:2 minutes;

5) 70% ethanol:2 minutes;

6) distilled water:5 min;

7) PBS (pH7.4)洗3次×3 min。

2、细胞通透、封闭并阻断内源性过氧化物酶的活性,

8) 用封闭通透液浸润切片30 min(室温、避光)。配法是用预热40 ml PBS加120ul TritonX-100加热几分钟后,临用前加400ul 30%H2O2。

9) PBS溶液洗3次×3 min。

3、抗原修复暴露抗原决定族

10) 切片放入0.01 M柠檬酸钠缓冲溶液(pH6.0)后,在微波炉里高火4 min至沸腾后,再加热约6 min×4次,每次间隔补足液体,防止干片。

4、封闭非特异性蛋白

11) PBS溶液洗3次×3 min;

12) 将切片取出,周围水分用滤纸吸干,用组化笔在组织周围画上圈,在圆圈内组织滴入5%羊血清(与二抗来源一致)后放入湿盒中,室温放置10-30 min;

5、一抗孵育

13) 甩去切片上的羊血清,用滤纸擦干组织周围残留血清,直接加入已稀释的一抗后,放入湿盒中室温1小时,然后4度过夜,从冰箱中取出需37°C复温45 min。

6、二抗孵育

14) 将一抗倒掉并用PBS洗5 min×5次;

15) 用滤纸将圆圈周围的水吸去,加入已稀释的二抗后放入37°C恒温烤箱中30 min。

16) 用PBS洗5次×5 min;

7、SP反应

17) 加入SP后放入37°C烤箱中30 min。

18) 用PBS洗5次×5 min;

8、显色

19) 加入DAB(快速滴入,观察染色情况,倒掉染液),显色时间控制在约5 min(3-10 min),由镜下观察颜色控制时间。0.05%DAB(避光)(1:20储备液):5 ul 20×DAB+0.1 ul 30% H2O2+95 ul PBS。1%DAB储备液的配制:50mg DAB+5ml 0.05 mol/L PBS充分溶解,-20 ℃保存。

9、复染、脱水、透明、封片

20) 用PBS 3次×3min后,用双蒸水洗5 min;

21) 加一大滴苏木素染液,胞核蛋白染几秒,胞浆或胞膜蛋白染20 s后自来水冲洗,双蒸水洗5 min,再用PBS返蓝5 min。

22) 脱水: 50% ethanol:1-2 min,

70% ethanol:1-2 min

95% ethanol:1-2 min;

95% ethanol:1-2 min;

100% absolute ethanol:(1-2) min;

100% absolute ethanol:(1-2) min。

23) 透明:Xylene 1×(1-2) min → Xylene 2×(1-2) min

24) 封片:中性树胶。

注:如果用DAB显色,则切片经过梯度酒精脱水干燥,(二甲苯透明),中性树胶封固;如果用AEC显色,则切片不能经酒精脱水,而直接用水性封片剂封片。

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