免疫组化实验中组织处理的主要方法和原则

进行适当的组织处理是做好免疫组化染色的先决条件,也是决定实验成败的内部因素,在组织细胞材料准备的过程中,不仅要求保持组织细胞形态完整,更要保持组织细胞的抗原性不受损或弥漫,防止组织自溶。如果出现自溶坏死的组织,抗原已经丢失,即使用很灵敏的检测抗体和高超的技术,也很难检出所需的抗原,反而往往由于组织的坏死或制片时的刀痕挤压,在上述区域易出现假阳性结果。

1、组织取材

组织标本及时的取材和固定是做好免疫组化染色的关键第一步,是有效防止组织自溶坏死,抗原丢失的开始,离体组织应尽快的进行取材,最好2h内,取材时所用的刀应锐利,要一刀下去切开组织,不可反复切拉组织,造成组织的挤压,组织块大小要适中,一般在2.5cm×2.5cm×0.2cm,切记取材时组织块宁可面积大,千万不能厚的原则,(也就是说组织块的面积可以大到3cm×5cm,但组织块的厚度千万不能超过0.2cm,否则将不利于组织的均匀固定)。固定液快速渗透到组织内部使组织蛋白能在一定时间内迅速凝固。从而完好的保存抗原和组织细胞形态。

2、组织固定

对于固定液的选择,原则上讲,应根据抗原的耐受性来选择相应的固定液,但除非是专项科研项目,在病理常规工作很难做到这一点,因为病理的诊断和鉴别诊断都是在常规HE病理诊断的基础上决定是否进行免疫组化的染色,而HE染色的常规组织处理是采用10%的中性缓冲福尔马林或4%缓冲多聚甲醛4倍于组织体积进行组织固定,利用其渗透性强,对组织的作用均匀进行固定,但组织固定时间最好在l2h内,一般固定时间不应超过24小时。随着固定时间的延长对组织抗原的检出强度将逐渐降低。

3、组织脱水、透明、浸蜡

组织经固定后进行脱水、透明、浸蜡和包埋。其操作原则是脱水透明要充分但不能过,浸蜡时间要够,温度不能高,否则造成组织的硬脆使组织切片困难,即使能切片,由于组织的硬脆,也使切片不能完好平整,染色过程中极易脱片,对免疫组化染色抗原的定位及背景都不利,所以无水酒精脱水和二甲苯透明的时间不宜过长,正常大小的组织无水酒精脱水lh×3次,二甲苯透明lh×2次即可,浸蜡及包埋石蜡温度不要超过65℃。

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