单细胞基因组测序技术新方法:微孔置换扩增系统

摘 要:

绝大部分微生物在实验室都不能培养,单细胞基因组测序技术可以使人们更深入的研究这些不能培养的微生物。单细胞基因组测序所面临的最大的技术障碍之一是扩增偏移(amplification bias)。美国的研究人员在这方面取得了突破性的成果,利用微孔置换扩增系统完成了单个大肠杆菌细胞以及人脑单个神经元细胞的完整基因组测序。

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单细胞基因组的测序一度引起许多不同领域研究人员的极大兴趣。例如,在从陆地到海洋的各种不同的环境中都存在着大量微生物,其中绝大部分微生物在实验室都不能进行培养,单细胞基因组测序技术可以使人们更深入的研究这些不能培养的微生物。此外,单细胞测序技术还可用来研究癌细胞、干细胞和人类的大脑,越来越多的研究显示构成人类大脑的细胞之间具有显著的基因组多样性。

但是在过去十多年里单细胞基因组测序所面临的最大的技术障碍之一就是扩增偏移(amplification bias)。扩增偏移是指扩增的步骤不均匀一致,扩增过程中基因组不同区域的拷贝数会有所不同。这种不均衡使得对许多下游基因组的分析变得更为复杂化,这其中包括从头组装基因组以及鉴别来自同一个体细胞之间的DNA内容物之间的差异。

Kun Zhang等的研究发现,来自于同一个大脑的不同神经元细胞之间,其遗传物质的构成也不同。因此他们致力于开发新的单细胞基因组测序技术,以便更深入地研究单细胞之间的基因组差异。

2013年发表在《自然·生物技术》(Nature Biotechnology)杂志第12期的一项研究表明,在美国加州大学圣地亚哥分校的研究人员利用微孔置换扩增系统(microwell displacement amplification system,MIDAS)完成了单个大肠杆菌细胞以及人脑单个神经元细胞的最完整基因组测序。这一突破性成果源自一种新的单细胞基因组测序技术,该技术在仅仅12纳升充满液体的小孔内完成了整个基因组的扩增。

单细胞基因组测序技术的突破,可以更好的检测单细胞中的基因组,使人们对大脑内基因组嵌合体(genomic mosaicism)的理解扩展到DNA水平。在基因组嵌合体中发现一些体细胞转变成了新的神经元细胞。这可能会为大脑内正常以及如阿尔茨海默症、帕金森病或精神分裂等疾病中的大脑异常提供一些新的见解。

微孔置换扩增系统是将单细胞随机分散到成百上千个纳升体积的微孔中,进行大规模的并行PCR扩增,然后用鸟枪法测序。整个测序过程中的反应是在12纳升(nL)体积的微孔中进行的,这是目前发表的有关单细胞基因组测序试验方案中所采用的最小体积的微孔。通过将扩增反应体积缩小1000倍至纳升水平,可以提高模板基因组的有效浓度,进而改善扩增的均一性,同时也减少了DNA污染,从而更好的完成单细胞基因组测序。

新的测序方法可以鉴别出小至100万个碱基对的单拷贝DNA获得或缺失,这是迄今为止单细胞测序方法所能达到的最高分辨率。而旧的单细胞测序技术只能发现至少300-600万碱基对的DNA拷贝的改变。

相比于此前所公布的最完整的单个大肠杆菌(E. coli)基因组数据,新方法获得了超过50%的大肠杆菌基因组序列,但测序所得的数据却比之前缩小了3-13倍。研究结果证实,用微孔置换扩增系统(MIDAS)提供了一种更为有效的方法,无需培养即可完成来自单个细胞的细菌全基因组测序。

单细胞基因组测序技术的突破是多学科交叉研究的成果,其中一个研究人员是微制造方向材料科学研究生,他创建了研究中所需的微孔阵列。如果没有微细材料和设备方面人员所给予的大力支持,这一项目不会取得成功的。

参考文献:

Gole J, Gore A, Richards A, et al. Massively parallel polymerase cloning and genome sequencing of single cells using nanoliter microwells. Nat Biotechnol. 2013,31(12):1126-32. doi: 10.1038/nbt.2720.

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