免疫组化实验操作的要点及技巧

(1)固定:最好用4%的多聚甲醛固定液。对于冰冻切片,甲醛固定有时比冰冻丙酮好;但对于不同的组织和抗原,可选用不同的固定液。 有时候商品化的抗体会有比较适合而推荐的固定液,请于购置前注意说明书。

Bouin S固定液:饱和苦味酸750ml,甲醛250ml,冰醋酸50ml,其对组织的穿透力较强,固定较好,结构完整,但因偏酸,对抗原有一定损害,且组织收缩明显,不适于组织标本的长期保存。

PLP液:即高碘酸钠-赖氨酸-多聚甲醛,适于固定石蜡切片。适于富含糖类组织,对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。

(2)组织脱水,透明:时间不能太长,否则在切片时容易碎片,切不完整。

(3)切片时展片:有些组织在切片后难以在水中展开,这时可适当地在水中加入几滴乙醇。

(4)烤片:60℃ 30分钟或37℃ 过夜,温度太高或时间太长,抗原容易丢失。

(5)蜡块及切片的保存:最好在4℃保存

(6)脱片问题

Poly-L-Lysine(多聚赖氨酸)为目前免疫组化染色工作中最常用的一种防脱片剂,6ml的多聚赖氨酸溶液可按1:10稀释成60ml的工作液,适合于需要酶消化、微波、高温高压的防脱片处理。如不行,可用双重处理(APES和Poly-L-Lysine)的切片。在以上两种条件都行不通的情况下,可用如下方法:切片在脱蜡前,放在APES 1:50 丙酮溶液中浸泡3分钟,晾干,即可进行下一步。

(7)灭活内源性酶:HRP系统:3%双氧水灭活;AP系统:3%HAc灭活。

(8)暴露抗原:对于石蜡切片的免疫组化实验时,必须采用高温加热抗原修复,这将有助于暴露抗原决定簇,从而增加免疫组化染色的强度(不同抗体的最佳修复液请参阅抗体说明书)。对于不同的组织,不同的抗原,不同的抗体,所采用的方法应不一样,可进行热修复、胰酶消化、既不修复也不消化。胶原还可以用胃蛋白酶消化等。

(9)封闭:在山羊血清封闭,非特异性染色仍然较强时,可延长封闭时间或用浓缩血清封闭

(10)抗体稀释:应遵循“现用现配”的原则,对于PBS稀释的抗体一定要当天使用。

(11)背景高:在抗体浓度、反应时间、反应温度等合适的条件下,如果背景依旧高,可采用含1‰ Tween20的PBS洗,特别是在显色之前要多洗。

(12)返蓝:在苏木素复染后,可用碱性缓冲液(如PBS)或Na2HPO4的饱和溶液返蓝。

(13)显色:一定要在显微镜下观察,注意控制背景。

(14)在整个操作过程中,切片千万不能干燥,否则会有非特异性染色。

(15)拍照

1)更换样品时,除了调整焦距和视野外,显微镜上的其他部件都不能动!所有的样品必须一次拍摄完全。特别是在拍摄过程中,不要一会用高倍镜,一会用低倍镜,来回切换物镜。

2)数码相机必须设置为手动曝光,并且保持每张照片用同样的曝光条件,同样的曝光时间,同样的光圈。特别要注意的是,一定要将数码相机的自动白平衡功能给关掉

3)免疫组化切片一般染色不太深,因此拍摄出的照片颜色较浅,就让它浅。拍摄出的照片中空白部位应尽可能呈现纯白色。测量其灰度应在250左右。如果呈现淡蓝色,一般是相机自动白平衡在起作用。另外一个因素是显微镜灯光电压不正确。要使灯光本身的色温正确。既不偏黄,也不偏蓝。

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