免疫荧光实验中常见荧光显色问题及原因分析

摘 要:

荧光背景过高的原因:抗体质量不高或浓度太高、封闭不完全、洗涤不充分等,还可通过调节荧光显微镜的参数来减低背景。荧光信号弱的原因:无目的蛋白或量极少、细胞通透性差、抗体浓度太低、二抗选择错误等。荧光猝灭快的原因:荧光素本身光稳定性差、未用防荧光猝灭剂封片。有自发荧光原因:使用戊二醛固定、材料本身有自发荧光等。

关键词:

1、荧光背景过高原因分析

(1)一抗质量不高,建议使用特异性高、效价高的一抗。

(2)一抗/二抗浓度太高,建议降低一抗/二抗浓度。

(3)封闭不完全,建议增加蛋白封闭时间。

(4)洗涤不充分,建议增加冲洗次数与时间。

(5)可通过调节荧光显微镜的参数来减低背景。

2、荧光信号弱或无信号原因分析

(1)无目的蛋白或表达量极少,建议选用表达量高的细胞或组织。

(2)细胞通透性差,建议增加通透剂的作用时间或浓度。

(3)一抗/二抗浓度太低,建议增大其浓度。

(4)二抗选择错误(种属不匹配),建议选用与一抗种属相匹配的二抗。

3、荧光猝灭快原因分析

(1)荧光素本身特性决定,光稳定性差,建议选用光稳定性好的荧光素二抗。

(2)用普通的封片剂封片,建议选用防荧光猝灭剂封片。

4、细胞有自发荧光原因分析

(1)使用了戊二醛固定,建议在固定后荧光染色前进行荧光淬灭,如使用NaIO4、NaBH4、甘氨酸等,染色前检查自发荧光。

(2)材料本身(如石蜡)有自发荧光,建议设立阴性对照,通过降低荧光显微镜的参数来消除背景染色。

(3)细胞成分中能够产生自发荧光的分子(例如核黄素、细胞色素等)的含量高;培养细胞中死细胞/活细胞比例高。

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