噬菌体的浓缩及氯化铯(CsCl)密度梯度离心方法

本方法主要参考《分子克隆指南》第三版中λ噬菌体颗粒的提取及密度梯度离心方法。

大肠杆菌λ噬菌体为例介绍噬菌体的浓缩及密度梯度离心方法。

(1)噬菌体颗粒的浓缩

① 将宿主菌划结培养,挑取单菌落接种到5 mL液体LB,37℃振荡培养过夜;

② 取1 mL过夜培养物,接种到100 mL液体LB,37℃振荡培养至对数生长初期。

③ 按感染复数为0.1的比例加入噬菌体,室温静置15min,37℃继续振荡培养6h;

④ 将培养裂解液于4℃ 4000rpm离心20 min,离心两次以除去细菌碎片;

⑤ 离心所得上清加入DNase I和RNaseA至终浓度为1ug/mL,室温放置30分钟;

⑥ 加入NaCl至终浓度为1mol/L,搅拌混匀,冰浴1小时,4℃,8000 rpm离心10min,去除细胞碎片,收集上清。注:加NaCl可促使噬菌体颗粒和细菌碎片分离,也是下一步从聚异二醇中有效沉淀噬菌体颗粒所必需;

⑦ 量取上清,按每100 mL上清液加10g的量加入PEG8000,轻缓颠倒使其溶解,禁剧烈,冰浴1小时以上,使噬菌体颗粒形成沉淀;

⑧ 4℃,10000 rpm离心10min,回收沉淀的噬菌体颗粒,弃上清将离心管倒置5分钟,尽量使残余液体流尽(可用移液器除去残余液体);

⑨ 用2mL SM缓冲液重悬沉淀;

⑩ 加入等体积氯仿抽提,37℃缓慢震荡30秒,4℃,4000 rpm离心15min,回收含噬菌体的水相,为初步浓缩的噬菌体颗粒,放置于4℃保存;

(2)噬菌体颗粒的密度梯度离心

① CsCl密度梯度液的配制

按下表制备各梯度液,在4mL半透明聚丙烯高速离心管中,按照从高密度到低密度的顺序,依次加入各梯度液。加样要缓慢轻柔,注意保持CsCl梯度液间的清晰界面;

 表   梯度液的制备

浮力密度(g/mL)          CsCl(g)               SM液(mL)

1.32                                          0.42                            0.90

1.45                                           0.60                           0.85

1.50                                           0.67                            0.82

1.70                                           0.95                             0.75

② 将含有粗制噬菌体颗粒的上清液小心加在梯度离心液上层,一定要保持界面的清晰。于4℃,25000 rpm水平离心2h;

③ 用无菌注射器小心从管壁插入,收集淡蓝色的噬菌体颗粒带;

④ 转入预先用透析液煮好的透析袋中,于4℃透析过夜,其间更换两次透析液,即可得到纯化的噬菌体颗粒。

⑤ 采用磷钨酸负染法,对纯化噬菌体颗粒的电镜观察。

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