常规两步法制备枯草芽孢杆菌感受态细胞及转化方法

摘 要:

枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备可以用于多种用途:(1)建立枯草芽孢杆菌转化体系;(2)对枯草芽孢杆菌进行基因改造;(3)提高枯草芽孢杆菌生产性能相关研究。下面介绍一种两步法制备枯草芽孢杆菌感受态细胞及转化方法。

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一、枯草杆菌普通化学感受态细胞制备及转化方法:

1)  将枯草芽孢杆菌菌种接种在LB平板上37 ℃培养1-2天,孢子形成率接近100%。

2)  用接种环接一环菌苔于5mL GM I 溶液,在30℃慢摇床(125 r/min)振荡培养过夜。

3)  次日取2 mL转接到18 mL GM I 中,37℃快摇床(250 r/min)培养3.5 h。

4)  再取10 mL上一步骤的培养液转接到90 mL GM II 中,37℃慢摇床培养90 min后,5,000 g,10 min离心收集菌体。

5)  用10 mL原培养液上清液轻轻悬浮菌体,悬浮后的菌体即为感受态细胞可以直接用来转化。

6)  感受态细胞的保存:加30%的灭菌甘油至终浓度为10%,混匀后分装到离心管中(0.5 mL/tube),随即放到-70 ℃保存。

7)  转化时取出离心管,放在45 ℃水浴中溶化,然后在0.5 mL菌液中加入适量DNA(~1 ug/ml)。

8)  于37 ℃振荡(200 r/min)培养30 -120 min后涂于相应抗性平板,再在37 ℃培养过夜,检查并验证转化子。

二、备用试剂:

[1]  10×最低盐溶液:K2HPO4 70 g,KH2PO4 30 g,(NH4)2SO4 10 g,(Na3C6H5O7•2H2O)5 g,MgSO4•7H2O 1 g,在蒸馏水中依次溶解,加水至500 mL。

[2]  氨基酸溶液(根据不同菌株的基因缺陷型准备,如WB600的氨基酸是 L- trp溶液):10 mg/mL,贮于棕色瓶内,113℃灭菌30 min,用黑纸包裹。

[3]  GM I溶液:1×最低盐溶液95.6 mL,20%葡萄糖2.5 mL,5%水解酪蛋白0.4 mL,10%酵母汁(yeast extract)1 mL,10 mg/mL氨基酸溶液0.5 mL(50 μg/mL)。

[4]  GM II溶液:1×最低盐溶液96.98 mL,20%葡萄糖2.5 mL,5%水解酪蛋白0.08 mL,10%酵母汁(yeast extract)0.04 mL,1 M MgCl2 0.25 mL(2.5 mM),1 M CaCl2 0.05 mL(0.5 mM),10 mg/mL氨基酸溶液0.1 mL(5 μg/mL)。

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