免疫组化技术之免疫酶法的技术原理及其分类

摘 要:

免疫酶法是借助酶细胞化学等方法显示组织抗原(或抗体)的新技术,在免疫荧光法的基础上发展起来的,其基本原理与免疫荧光法相似,免疫酶法是将酶以共价键的形式结合在抗体上,制成酶标抗体,再借助酶对底物的特异催化作用,生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒,于光镜或电镜下进行细胞表面或细胞内部各种抗原成分的定位。

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免疫酶法是借助酶细胞化学等方法显示组织抗原(或抗体)的新技术,是在免疫荧光法的基础上发展起来的。

一、免疫酶法与免疫荧光

免疫酶法的基本原理与免疫荧光法相似,免疫酶法是将酶以共价键的形式结合在抗体上,制成酶标抗体,再借助酶对底物的特异催化作用,生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒,于光镜或电镜下进行细胞表面或细胞内部各种抗原成分的定位。

免疫荧光法具有操作简便、灵敏、特异性高、省时的优势,但同时也具有令人遗憾的不足,特别是荧光标本不能长期保存以及需要价格昂贵的荧光显微镜才能观察的问题。为此,Nakane等人(1966)尝试了用酶代替荧光素来标记抗体的方法,从而成功地开创了酶标记抗体的新技术(酶标抗体法)。

免疫酶法与免疫荧光法相比较,具有以下优点:酶反应产物呈现的颜色不仅能在一般的普通生物显微镜下观察,而且其产物因具有一定的电子密度,也可在电镜下观察(免疫电镜技术),光镜与电镜的结合,使灵敏度进一步提高,标本又能长期保存,并能加设HE染色等其他复染,有利于将被检测物质与病变的形态学改变联系起来(定性与定位),弥补了免疫荧光法的不足。

二、免疫标记用酶

从理论上讲,用细胞化学方法能显示的酶,均可用于标记抗体进行免疫酶法染色,但实际上能用于免疫组织化学技术的酶并不多,最为常用的酶是辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP),其次是碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,AKP)。除此两种外,还有葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase,GOD)等,但因其形成的不溶性色素扩散作用较大,在应用上受到很大限制。

三、免疫酶法的分类

免疫酶法与免疫荧光法大致相同,也可以分为以下几种。

1)直接法

用酶标记的特异性抗体直接与标本中的相应抗原反应结合,再与酶的底物作用产生有色的产物,沉积在抗原抗体反应的部位,即可对抗原进行定性、定位以至定量研究。

直接法的第一步是特异的,即酶催化底物的反应。其余步骤则是非特异的,可用各种电子供体介导。

直接法的优点是简便、快速、特异性强,非特异性背景反应低。其缺点是,每种抗原必须分别用其抗体的酶标记物,且敏感性较间接法低。

2)间接法

间接法是先用未标记的特异性抗体(一抗)与标本中相应抗原反应,再用抗特异性抗的酶标记抗体与结合在抗原上的一抗(即特异性抗体)反应。

例如,如果使用的特异性抗体(一抗)是由家兔产生的,则二抗必须是酶标记的抗兔的免疫球蛋白,常用的羊抗兔lgG的酶标记物(即酶标羊抗兔IgG)。然后与直接法相同,与底物反应、显色、将抗原的性质,部位和含量检测出来。

间接法的优点是用一种酶标抗体就可与多种特异性一抗配合而检查多种抗原,而且敏感性也优于直接法。

3)酶桥法

酶桥法用化学交联法将酶与抗体分子结合的技术改进为用酶和酶抗体免疫反应而结合的方法,避免了由于化学反应过程中对酶活性和抗体效价的不良影响。

酶桥法的基本原理是用酶免疫动物,制备高效价、特异性强的抗酶抗体,然后用第二抗体作桥,将抗酶抗体和特异性的第一抗体(即连结在组织抗原上的抗体)连接起来,再将酶结合在抗酶抗体上,经过酶催化底物的显色反应后,显示出抗原所在的部位及含量。

4PAP

PAP法是在酶桥法等基础之上建立的,其基本原理与酶桥法相似,都是利用桥抗体将  酶连接在第一抗体结合的部位,所不同的是,将酶和抗酶抗体制成复合物(PAP)以代替酶桥法中的抗酶抗体和随后结合的酶,将两个步骤合并为一个步骤,这一重要的改进,不仅仅是简化步骤,而具有更大的优势。有研究表明,PAP法比酶桥法的灵敏度高20倍,有人认为是免疫荧光法的100-1000倍。PAP法的不足之处是PAP的制备较为复杂。

5APAAP

APAAP——碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase antialkaline phosphatase, APAAP)法是Mason和Moir(1983)等在PAP法的基础上,用AKP替代HRP而建立的一种方法,都属于未标记抗体桥联法。APAAP法与PAP一样,利用桥抗体将AKP连接在第一抗体的结合部位,而AKP和抗AKP抗体被制成复合物(APAAP),通过APAAP复合物中的AKP催化底物显色以显示抗原物质。

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