免疫荧光技术常用的荧光色素和方法分类

摘 要:

免疫荧光法是基于抗原抗体特异性结合的原理,将已知的抗体或抗原分子标记荧光色素,与相应的抗原或抗体反应后,在荧光显微镜下可见发出荧光的抗原抗体结合部位,从而进行定位或定量分析。常用的荧光色素包括FITC和TRITC。按照抗原抗体反应的结合步聚,免疫荧光技术可分为直接法、间接法、补体法和双重免疫荧光法。

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免疫荧光法(Immunofluorescence)是最早建立的免疫组织化学技术,免疫荧光法的基本原理是抗原抗体特异性结合的原理,将已知的抗体或抗原分子标记上荧光素,当与其相对应的抗原或抗体起反应时,在形成的复合物上就带有一定量的荧光素,在荧光显微镜下可以看见发出荧光的抗原抗体结合部位,从而可确定组织中某种抗原的定位,进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便,所以在临床病理诊断、检验中应用比较广。

一、常用的荧光色素

1)异硫氰酸荧光素(fluorecein isothiocyanteFITC

黄色、橙黄色或褐黄色结晶粉末,有两种异构体,易溶于水和酒精等溶剂。分子量为389,最大吸收光谱为490~495,最大发射光谱为520~530urn,呈现明亮的黄绿色荧光,是最常用的标记抗体的荧光素。

2)四甲基异氰酸罗达明(tetrametrylrhodarnine isothiocyanteTRITC

一种紫红色粉末,较稳定,是罗达明(rhodamine)的衍生物。最大吸收光谱550urn,最大发射光谱620urn呈橙红色荧光,与FITC发射的黄绿色荧光对比鲜明,常用于双标记染色。

二、免疫荧光技术的分类

按照抗原抗体反应的结合步聚,免疫荧光技术可分为以下四种:

1)直接法

用荧光素标记的特异性抗体直接与相应的抗原结合,以检查出相应的抗原成分。

2)间接法

先用特异性抗体与相应的抗原结合,洗去未结合的抗体,再用荧光素标记的抗特异性抗体(间接荧光抗体)与特异性抗体相结合,形成抗原一特异性抗体一间接荧光抗体的复合物。在此复合物上带有比直接法更多的荧光抗体,所以,此法较直接法灵敏,但特异性可能稍差。

3)补体法

用特异性的抗体和补体的混合液与标本上的抗原反应,补体就结合在抗原抗体复合物上,再用抗补体的荧光抗体与之相结合,就形成了抗原一抗体一补体一抗补体荧光抗体的复合物。荧光显微镜下所见到的发出荧光的部分即是抗原所在的部位。补体法具有敏感性强的优势,同时适用于各种不同种属来源的特异性抗体的标记显示,在各种不同种属动物抗体的检测上为最常用的技术方法。

4)双重免疫荧光法

在对同一组织细胞标本上需要检测两种抗原时,可进行双重荧光染色,即将两种特异性抗体(例如抗A和抗B)分别以发出不同颜色的荧光素进行标记,抗A抗体用异硫氰酸荧光素标记发出黄绿色荧光,抗B抗体用四甲基异硫氰酸罗明达标记发出橙红色荧光,将两将荧光抗体按适当比例混合后,加在标本上(直接法)就分别形成抗原抗体复合物,发出黄绿色荧光的即抗A抗体结合部位,发出橙红色荧光的即抗B抗体结合的部位,这样就明确显示两种抗原的定位。

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