SEM(Simple and Efficient Method)法制备超级感受态细胞方法

摘 要:

在实验中,有时候需要转化效率比较高的感受态进行转化,如在建库或者转化比较珍贵的材料时,用普通方法制备的感受态就不能满足实验需要。超级感受态的转化效率比普通感受态高得多,转化效率可以达到109或1010,因此可以用超级感受态进行转化。下面是超级感受态的制备方法。

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在实验中,有时候需要转化效率比较高的感受态进行转化,如在建库或者转化比较珍贵的材料时,用普通方法制备的感受态就不能满足实验需要。超级感受态转化效率比普通感受态高得多,转化效率可以达到109或1010,因此可以用超级感受态进行转化。下面是超级感受态的制备方法。

一、材料准备

1) 250 ml TB溶液

10mM Pipes or 10 mM Hepes,0.65g

15 mM CaCl2,0.55g

250 mM KCl,4.66g

55 mM MnCl2,2.47g

除MnCl2外,将其它成份溶解于ddH2O后,用0.1M HCl调节pH值至6.7(如果HCl加过量了,必须废弃溶液后重新配制,不能用碱再调低pH值后使用),然后将2.475g MnCl2加入溶液,溶解后定容,用0.45 um孔径的滤膜过滤除菌,分装为每瓶50 ml,4°C贮存备用。

2) 其它溶液

  1. 250 mM KCl溶液100 ml:将1.86 g  KCl溶解到100 ml ddH2O。
  2. 1M MgCl2 +1 M MgSO4溶液10 ml:先配制1M MgCl2溶液,然后加入MgSO4,溶解后高压灭菌。
  3. 50 ml of 1 M glucose with ddH2O, filter, aliquot in 1.5 ml, store at -20°C
  4. 100 ml SOB培养基:

蛋白胨(Bacto tryptone):2 g

酵母提取物(Bacto yeast extract):0.5 g

NaCl:0.05 g

上述成份溶解于ddH2O后,加入10 ml 250 mM的KCl溶液,用5N NaOH调节pH值至7.0 (~0.2 ml),用ddH2O定容至100 ml,高压灭菌后待用。

使用前,在100 ml SOB培养基中加入1 ml 2M Mg2+ (终浓度为20mM)。

  1. SOC培养基:

在SOB培养基中加入葡萄糖至终浓度为20 mM即为SOC培养基

3) 高压灭菌的500 ml锥形瓶。

二、超级感受态制备方法:

1、将冻存的DH5α接种到2 ml SOB培养基,37°C振荡培养。

2、取1 ml培养液接种到100 ml SOB,37°C培养2~2.5 h,细菌浓度约为4 ~7×107CFU/ml或OD600值为0.5。每20~30 min测定1次OD600值。

3、将培养液分装到2个离心管,每管50 ml,冰浴10-15 min.

4、 750-1000 g (2000-3000 rpm),4°C离心12 min,完全去除液体,收集菌体。

5、每个离心管加入1 ml TB,用移液器轻柔吹打重悬菌体。菌体完全分散后,每管再加入9ml TB,将两管重悬液合为1管,冰浴15 min。

6、750-1000 g ,4°C离心收集菌体。

7、加入1 ml TB,用移液器轻柔吹打重悬菌体。菌体完全分散后,每管再加入7ml TB(终体积与原始菌液体积比为1:12.5)。

8、在8 ml重悬液中加入280μl DMSO冰浴15 min,分装于预冷的离心管,每管100μl,在液氮中速冻,然后-70°C冻存备用。

三、注意事项

1、所用器具的洁净程度。这一点非常重要,所有与感受态有关的方法与文章必强调这一点,其重要性毋庸置疑。

2、培养基的装量。培养基的装量是很重要的,这关系到菌体生长过程中的能量代谢问题,是有氧还是无氧生长。厌氧生长出来的菌体是做不出效率高的感受态的。建议装量不要高于此值:培养基体积/三角瓶容量=100ml/500ml,50ml/250ml。

3、培养基的pH值。pH值并非单指配制或灭菌后的pH值,而且还包括整个摇瓶结束后的pH值。一般来说,接种前的pH值在6.8-7.2。等菌摇好后,可以测一下pH值,不要低于6.0,最好在6.5以上。这表示菌体的代谢为有氧代谢,生长状态良好,按要求做,肯定效率不低。

4、培养后的OD值。这是一个非常重要的参数,只是当OD值达到一定的程度后,菌体要保持对数生长已经不太可能,因此很多指导方法上强调OD不得大于 0.6、0.8等等。同时,OD值大时菌体总量大,感受态绝对数量要大一点。因此需要在OD值的两方面影响中找一个平衡点。

5、培养基中的各种离子。当培养基中存在一定量的Mg2+离子时,该方法制得的感受态效率相对较高。在制备普通感受时,使用20mM MgCl2做为培养基的添加物,在感受态收获之前20-30分钟加入,会收到很好的效果。

6、培养温度。较低的温度培养有利于感受态的形成,可以获得较高的感受态,但太低又不实用。

7、在保存感受态时,DMSO要比甘油的效果要好,能显著增加感受态的效率。

8、液氮速冻也会增加感受态的效率,因此推荐用液氮速冻感受态,然后保存于超低温冰箱内。

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