免疫组化的实验器材、试剂及实验步骤

1.仪器设备

18cm不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉,水浴锅。

2.试剂

(1)PBS缓冲液(pH7.2~7.4):NaCl 137mmol/L,KCl 2.7mmol/L,Na2HPO4 4.3mmol/L, KH2PO4 1.4mmol/L。

(2)0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液(CB,pH6.0,1000ml):柠檬酸三钠 3g,柠檬酸 0.4g。

(3)0.5mol/L EDTA缓冲液(pH8.0):700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O,用10 mmol/L NaOH调至pH8.0,加水至1000ml。

(4)1mol/L的TBS缓冲液(pH8.0):在800ml水中溶解121gTris碱,用1N的HCl调至pH8.0,加水至1000ml。

(5)酶消化液: a、0.1%胰蛋白酶液:用0.1%CaCl2(pH7.8) 配制。 b、0.4%胃蛋白酶液:用0.1N的HCl配制。

(6)3%甲醇-H2O2溶液:用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。

(7)封裱剂:

a 甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液(pH9.0~9.5)等量混合;

b 油和TBS(或PBS)配制。

(8)TBS/PBS pH9.0~9.5,适用于荧光显微镜标本;pH7.0~7.4适合于光学显微镜标本。

3.操作流程

(1)脱蜡和水化

脱蜡前,应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。

1)组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后再浸泡10分钟;

2)无水乙醇中浸泡5分钟;

3)95%乙醇中浸泡5分钟;

4)70%乙醇中浸泡5分钟;

(2)抗原修复

用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。

1)抗原热修复

在沸水中加入EDTA(pH8.0)或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)。盖上不锈钢高压锅的盖子,但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上,缓慢加压,使玻片在缓冲液中浸泡5分钟,然后将盖子锁定,小阀门将会升起来。10分钟后,去除热源,置入凉水中,当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。

2)煮沸热修复

电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)至95℃左右,放入组织芯片加热10~15分钟。

3)微波热修复

在微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)至沸腾后将组织芯片放入,断电,间隔5~10分钟,反复1-2次。适用的抗原有:AR,Bax,Bcl-2,C-fos,X-jun,C-kit,C-myc,E-cadherin,Chromogranin A,Cyclin,ER,Heat shock protein,HPV,Ki-67,MDMZ,p53,p34,p16,p15,P-glycoprotein,PKC,PR,PCNA,ras,Rb,TopoismeraseⅡ等。

4)酶消化方法

常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热至37℃,切片也预热至37℃,消化时间约为5~30分钟;胃蛋白酶消化37℃时间为30分钟。适用于被固定遮避的抗原,其中有:Collagen,Complement,Cytokeratin,C-erB-2,GFAP,LCA,LN等。

(3)免疫组织化学染色

SP法

1)脱蜡、水化;

2) PBS洗2~3次各5分钟;

3)3%H2O2(80%甲醇)滴加在TMA上,室温静置10分钟

4)PBS洗2~3次各5分钟;

5)抗原修复;

6)PBS洗2~3次各5分钟;

7)滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟。甩去多余液体。

8)滴加Ⅰ抗50μl,室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。

9)4℃过夜后需在37℃复温45分钟。

10)PBS洗3次各5分钟;

11)滴加Ⅱ抗40~50μl,室温静置,或37℃1小时;

12)抗中可加入0.05%的tween-20;

13)BS洗3次各5分钟;

14)DAB显色5~10分钟,在显微镜下掌握染色程度;

15)PBS或自来水冲洗10分钟;

16)苏木精复染2分钟,盐酸酒精分化;

17)自来水冲洗10~15分钟;

18)脱水、透明、封片、镜检。

SABC

1)脱蜡、水化。

2)PBS洗两次各5分钟。

3)用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2,室温封闭5~10分钟,蒸馏水洗3次。

4) 抗原修复。

5) PBS洗5分钟。

6) 滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟。甩去多余液体。

7) 滴加Ⅰ抗,室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时(4℃过夜后在37℃复温45分钟)。

8) PBS洗三次每次2分钟。

9) 滴加生物素化二抗,20℃~37℃20分钟。

10)PBC洗3次每次2分钟。

11)滴加试剂SABC,20℃~37℃20分钟。

12)PBS洗4次每次5分钟。

13)DAB显色:DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色(镜下掌握显色程度)。

14)蒸馏水洗。苏木素复染2分钟、盐酸酒精分化。

15)脱水、透明、封片、镜检。

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