枯草芽孢杆菌电转化感受态细胞制备及电转化方法

摘 要:

芽孢杆菌的生物学特性比较特殊,比其它细菌的转化效率低得多。普通制备细菌电转化感受态细胞的方法不适用于芽孢杆菌。Gang-Ping Xue等建立了利用高渗透法提高枯草芽孢杆菌转化效率的方法,后来该方法经过改良,形成了如下枯草芽孢杆菌电转化方法,其转化效率能够满足通常的实验需要。

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由于芽孢杆菌的生物学特性比较特殊,在转化时比革兰氏阴性菌效率低得多,甚至比其它革兰氏阳性菌的转化效率也低得多。普通制备细菌电转化感受态细胞的方法不适用于芽孢杆菌,很难获得转化子。Gang-Ping Xue等建立了利用高渗透法提高枯草芽孢杆菌转化效率的方法,后来该方法经过改良,形成了如下枯草芽孢杆菌电转化方法,其转化效率能够满足通常的实验需要。

一、枯草芽孢杆菌电转化方法(高渗透法):

1、接种枯草芽孢杆菌(B . subtilis)于5ml LB培养基中,过夜培养。

2、取2.5ml过夜培养物接入40ml(LB + 0.5M 山梨醇)中,37℃,200rpm振荡培养至OD600为0.85~0.95之间。

3、将菌液冰水浴10 min,然后5000g,4℃离心5 min,收集菌体。

4、用50ml预冷的电转培养基(0.5M山梨醇,0.5M甘露醇,10%葡萄糖)重悬菌体,5000g,4℃离心5min,去上清,如此漂洗4次。

5、将洗涤后的菌体重悬于1ml电转培养基中,分装于EP管,每管分装60μl。

6、将50ng质粒DNA(1~8μl)加入到60μl感受态细胞中,冰上孵育2min,加入预冷的电转杯(1mm)中,电击。

电转化参数设置:2.0kv、1mm、电击1次。(电击结果:时间常数=4.5~5.0ms,如果时间常数<4.2,则需要增加电转培养基的漂洗次数或者提高感受态的稀释倍数来获得更高的转化效率)。

7、电击完毕后,取出杯子并立即加入1ml RM (LB + 0.5M山梨醇+0.38M甘露醇),37℃,200rpm振荡复苏培养3h后,涂板。37℃温箱培养过夜。

二、试剂准备:

1、40ml (LB + 0.5M山梨醇):蛋白胨10g/l,酵母粉5g/l,NaCl 10g/l,山梨醇3.6g,pH=7.2。

2、200ml电转培养基(0.5M山梨醇,0.5M甘露醇,10%葡萄糖):山梨醇18g,甘露醇18.5g,葡萄糖20g。

3、10ml RM(0.5M山梨醇,0.38M甘露醇):山梨醇0.9g,甘露醇0.7g。 2个50ml离心管,灭菌。

三、说明事项:

1、电转从感受态制备到电击完成都要保持低温:感受态细胞从-80冰箱拿出来后在冰上融化,DNA样品加入感受态也要在冰上完成。

2、制备感受态用的器皿(三角瓶,离心杯)都要洗刷干净,不要有任何去污剂和离子的残留。

3、摇菌的OD值不要超过1,摇完菌后置冰水浴中骤冷。

4、培养基中的山梨醇和甘露醇都的作用是提供渗透压。

5、电转培养基的葡萄糖,可用甘油代替,浓度同为10%。

6、该方法的原始文献:Gang-Ping Xue, Jennifer S Johnson, Brian P Dalrymple. High osmolarity improves the electro-transformation efficiency of the gram-positive bacteria Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis. Journal of Microbiological Methods, 1999,34(3):183-191.

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