常用的siRNA制备方法及优缺点分析

摘 要:

常用的siRNA制备方法包括化学合成、体外转录、长片断dsRNAs经RNase III 类降解、通过siRNA表达载体或者病毒载体制备、PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达产生siRNA等方法。这些方法各自都有其优缺点,不同的实验或生产可能用到不同的方法。

关键词:

目前为止较为常用的siRNA制备方法包括通过化学合成、体外转录、长片断dsRNAs经RNase III 类降解 (e.g. Dicer, E. coli, RNase III)体外制备siRNA、以及通过siRNA表达载体或者病毒载体,PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达产生siRNA等方法。

1、化学合成法制备siRNA

是一种非常方便、但成本较高的siRNA制备方法,许多公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA。主要缺点是成本高、定制周期长。也有说这种方法的效率只有转录合成的1/10-1/40,基因抑制持续时间短,对细胞毒性大,转染效率低。因此该方法适用于已经找到最有效的siRNA的情况下,需要大量制备siRNA进行研究。

2、生物转录合成法制备siRNA

以DNA Oligo为模版,通过体外转录合成siRNAs,这种制备方法成本相对化学合成法低,是一种性价比高的筛选siRNAs的好方法。体外转录合成siRNA,比较接近生理状态,得到的siRNAs毒性小、稳定性好、效率高,低浓度的siRNA即可达到抑制效果。该方法的主要缺点是制备规模受到限制,难以大量的生产。因此这种方法适于用筛选siRNAs,特别是需要制备多种siRNAs时使用,而不适用于需要大量制备某一特定的siRNA。

3、Dicer酶法制备siRNA

这种方法可以跳过筛选与检测有效siRNA序列的步骤,从而节省时间和开支。但有可能引起非特异性的基因沉默,尤其是同源或者密切相关的基因。因此这种方法适用于快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型,而不适用于长期研究某一特定的siRNA。

4、编码shRNA的载体制备siRNA

这种方法制备质量可控性好,带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达,持续数星期甚至更久,可以大量扩增。但不能保证转录后shRNA的正确折叠率,有可能造成非特异性抑制,质粒载体转染效率不稳定,与细胞类型有关。因此该方法适用于已知的特定的的siRNA序列,需要维持较长时间的基因沉默,或者需要用抗生素筛选能表达siRNA的细胞,不适用于大量筛选siRNA序列用。

5、病毒粒子制备shRNA

易于制备、纯化、浓缩,宿主范围广,感染率高,理化性质稳定,不整合宿主基因组,遗传毒性和免疫毒性低,是目前最好的RNA干扰技术之一。但该方法耗费时间较长,即使是用最快的也得60天左右,对实验条件要求较高,容量偏小,有可能伴随部分炎症反应。因此该方法适用于只需要维持较短时间的基因沉默的siRNA,不适用于大量筛选siRNA或长时间的研究,主要原因是成本因素。

6、PCR制备shRNA表达框生产siRNA

这种方法成本较低、方便快捷、可以用于有效序列的筛选,可以用于质粒载体构建,但转染效率较低,因此该方法适用于筛选siRNA序列,在克隆到载体前筛选最佳启动子,不适合大规模制备。

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