RNA干扰(RNAi)实验目标序列的选取方法和原则

RNA干扰是指利用特定序列的正义和反义RNA组成的双链RNA (double-stranded RNA,dsRNA)干扰、破坏目标基因的转录产物mRNA,从而表现为靶基因的沉默并丧失其功能。

 虽然RNA干扰是一种非常具有应用前景的新技术,但是在哺乳动物中随机选择的RNAi,其中有70-80%都不表现出RNA干扰效果,这对在哺乳动物中利用RNAi进行基因功能分析提出了问题。目前在设计小干扰RNA时,依赖试验者的经验、感觉的部分很多,很难高准确率地设计能够产生实际RNA干扰效果的小干扰RNA。另外,因为RNA合成需要时间、费用,所以,为筛选合成的小干扰RNA而合成大量的无效的小RNA,会浪费很大的时间成本和费用成本。

为了有效选择进行靶基因RNA干扰的目标序列,下面总结了一些通用的方法和原则:

1、从转录本(mRNA)的AUG起始密码开始,寻找“AA”二连序列,并记下其3'端的19个碱基序列,作为潜在的siRNA靶位点。有研究结果显示GC含量在45%―55%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。

Tuschl等建议在设计siRNA时不要针对5'和3'端的非编码区(untranslated regions,UTRs),原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域,而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果。

2、将潜在的序列和相应的基因组数据库(人、小鼠、大鼠等)进行比较,排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。

3、选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA,以找到最有效的siRNA序列。

4、从RNA干扰的目标基因的序列中查找符合下列条件的序列部位:3'末端的碱基是腺嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶,且3'末端的7碱基序列中富含由腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶组成的群组;5'末端的碱基是鸟嘌呤或胞嘧啶;碱基数在能够产生RNA干扰且不产生细胞毒性的范围内。

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