RNA干扰(RNAi)导致基因沉默的分子机制与原理

RNA传统上仅被认为有两种功能。mRNA是基因表达的重要分子,在DNA和蛋白质之间传递遗传信息,核糖体RNA和转运tRNA是结构因子,在蛋白质合成过程中起催化及携带遗传信息的作用。直至1998年,Andrew Fire Craig Mell及其同事宣布他们发现RNAi,并在秀丽线虫(C. elegant)体内成功的利用dsRNAs分子进行了基因沉默实验。

将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA (dsRNA)导入细胞,介导靶mRNA发生特异性的降解,导致mRNA翻译被抑制,从而使相应的基因沉默。这种转录后基因沉默机制(post-transcriptional gene silencing,PTGS)被称为RNA干扰(RNAi),其基本分子机制和原理包括2个阶段。

一、Dicer和dsRNA作用阶段,也称RNAi起始阶段(inititation step)

长dsRNAs被切割为21-23核苷酸长的小分子干扰RNA片段 (small interfering RNAs,siRNAs)。其中含有19-21nt dsRNA和2nt的末端单链。剪切dsRNAs成siRNAs的酶为Dicer。Dicer酶是RNase III家族中特异识别双链RNA的一员,它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因、病毒感染等各种方式引入的双链RNA,切割将RNA降解为19-21bp的双链RNAs (siRNAs),每个片段的3’端都有2个碱基突出。

二、RISC的形成和作用阶段,也称RNAi效应阶段 (effector step)。

在RNAi效应阶段,siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex,RISC)。RISC是由siRNA/miRNA、Dicer酶、DadR蛋白和Argonaute家族蛋白组成的复合体,其作用是直接造成与复合体中siRNA高度互补的mRNA被降解。激活RISC需要一个ATP依赖的将小分子双链RNA解链的过程。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上,并在距离siRNA 3’端12个碱基的位置切割mRNA。目前这种切割的确切机制尚不明了,但每个RISC都包含一个siRNA和一个不同于Dicer的RNA酶。

在形成RISC复合物后,其中的siRNA解旋形成单链RNA。RISC被活化后,活化型RISC受已成单链的siRNA引导,序列特异性地结合在胞内存在的目的mRNA上并将其切断成小片段,引发目的mRNA的特异性降解。这些断裂的小片段能够形成新的siRNA,进而形成RISC,这样就形成了一个级联放大反应,将细胞中的目的mRNA完全裂解。

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