Trizol法提取动植物及微生物总RNA的方法(Protocol)及注意事项

Trizol 是一种新型总RNA 抽提试剂,内含异硫氰酸胍等物质,能迅速破碎细胞,抑制细胞释放出的核酸酶。TRIzol的主要成分是酚,主要作用是裂解细胞,使细胞中的蛋白,核酸物质解聚得到释放。酚虽可有效的变性蛋白质,但是它不能完全抑制RNA酶活性,因此Trizol 中还加入了8-羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。

Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌,样品量从几十毫克至几克。用Trizol法提取的总RNA没有蛋白和DNA污染。可直接用于Northern斑点分析、斑点杂交、体外翻译分子克隆等下一步实验。

一、提取RNA前的准备

1、研钵的处理:1) 自来水反复冲洗;2) 去污剂或者洗涤灵冲洗;3) 自来水反复冲洗;4) 蒸馏水浸泡1~2d;5) 超净工作台内用无水乙醇冲洗2~3遍,晾干。(在RNA提取前,紫外杀菌10min)。

2、枪头及EP管的处理:1) 0.1%DEPC水浸泡1~2w;2) 用镊子夹起枪头装入枪头盒中,用镊子夹起EP管放入饭盒; 3) 高压灭菌50min,45度烘箱烘干。

3、75% Ethanol(in DEPC-treated water):用分析纯无水乙醇并用0.01%的DEPC处理过的无Rnase的水稀释。

4、RNase-free water:无Rnase的水。方法是:将DEPC按0.01%(V/V)加在ddH2O中500 ml(50 ul),在37℃过夜,并高压灭菌即得(121℃ 3小时)

二、实验操作步骤

1、将组织在液氮中磨成粉末后,以50-100 mg组织加入1 ml Trizol液研磨,注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%;提取细胞RNA时,先离心沉淀细胞,每5-10×106个细胞加1 ml Trizol,反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞。

2、将组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管,在室温放置5分钟;然后以每1 ml Trizol液加入0.2 ml的比例加入氯仿,盖紧离心管,剧烈摇荡离心管15秒。在室温放置2~3分钟,12 000 g(2-8℃)离心15分钟。

3、取上层无色的水相(RNA包含在水相中,水相的体积约相当于所加的Trizol试剂量的60%)于新离心管,按每1 ml Trizol液加0.5 ml异丙醇的比例加入异丙醇,室温放置10分钟,12 000 g(2-8℃)离心10分钟。

4、弃上清液(RNA沉淀为一层如凝胶样透明的小块附在管底和管壁),按每1 ml Trizol液加入至少1 ml的比例加入75%乙醇进行洗涤,涡旋混匀,4℃下7 500 g离心5分钟。

5、小心弃上清液,沉淀在室温下自然干燥或真空干燥5-10分钟,注意不要干燥过分,否则会使RNA失去溶解性。

6、 加适量Rnase-free water溶解RNA沉淀,用枪头反复吸取混匀,55-60℃水浴10-15min。进行下游实验或-70℃保存备用。

7、RNA可进行mRNA分离,或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。

三、注意事项

1、为避免RNA酶的降解作用,在收集到生物材料之后,最好能即刻进行RNA制备工作。若需暂时储存,则应以液氮将生物材料急速冷冻后,储存于-80℃冷冻柜。

2、在制备RNA时,将储存于冷冻柜的材料取出,立即以加入液氮研磨的方式打破细胞,不可以先行解冻,以避免RNase的作用。

3、整个操作要带口罩及一次性手套,并尽可能在低温下操作。另外,提取上清这步一定要小心,靠近沉淀的部分一定要舍弃,否则会有蛋白质污染。

4、加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上,RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周,-20℃保存一年。

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