防止RNA酶污染的方法及常见RNA酶抑制剂

在进行RNA相关的实验过程中,最令实验人员头痛的事情就是RNA酶(RNase)的污染,导致实验经常失败。一方面由于RNA酶在环境中广泛存,如操作人员的手汗、唾液等,也可存在于灰尘中,在其它人员实验中使用的RNA酶也会造成污染,而且各种组织和细胞中也含有大量内源性的RNA酶。另一方面由于RNA酶非常稳定,可耐受多种处理而不被灭活,如煮沸、高压灭菌等,即使在一些极端的条件可以暂时失活,但限制因素去除后又迅速复性。因此在进行RNA相关的实验时,为了获得高质量的RNA,必须采取一些措施来防止RNA酶的污染,或使用RNA酶抑制剂最大限度地降低RNA酶的活性。

一、防止RNA酶污染的方法:

1、玻璃或金属制品:使用前必须于180℃干烤8小时或250℃烘烤3小时以上。也可用0.1%的DEPC水溶液浸泡处理。

2、塑料制品:尽可能使用无菌、一次性、标明RNase-free的塑料制品,如没有开封使用过,通常没有必要再次处理,再次处理容易造成二次污染。但原则上国产塑料制品要用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)水浸泡或用氯仿冲洗处理后方可使用。处理方法如下:

(1)在玻璃烧杯中注入去离子水,加入DEPC至终浓度为0.1%。

(2)将待处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中,加入DEPC水溶液,使塑料制品完全浸泡到溶液中。

(3)在通风柜中37℃或室温下处理过夜。

(4)将EDPC水溶液小心倒入废液瓶中,用铝箔封住含DEPC水处理过的塑料制品的烧杯,高温高压蒸气灭菌至少30分钟。上述处理可以除去器皿上痕量的DEPC,以防DEPC通过羧甲基化作用对RNA的嘌呤碱基进行修饰。

(5)80-90℃烘烤至干燥,置于干净处备用。

3、电泳槽等:可先用去污剂洗涤,双蒸水冲洗,乙醇干燥,再浸泡在3% H2O2 室温放置10 min,然后用0.1% DEPC水冲洗,晾干。

4、溶液:用高压灭菌的水和RNA研究专用的化学试剂配制溶液,配制的溶液应尽可能用0.1% DEPC,在37℃处理12 h以上。然后于100℃加热15分钟或在15 lbf/in2 (1.034×105Pa)的高压下蒸气灭菌30分钟。不能高温处理的试剂,应用DEPC处理过的无菌双蒸水配制,然后经0.22μm滤膜过滤除菌。

5、移液器:移液器就RNase的一大污染源。根据移液器制造商的要求对移液器进行处理。一般情况下用DEPC配制的70%乙醇擦洗移液器的内部和外部,基本达到要求。移液器金属退头器是RNA酶的一个重要来源,实验前最好取下它。

6、实验人员:戴一次性口罩、 帽子、手套,实验过程中手套要勤换。

7、设置RNA操作专用实验室,所有器械等应为专用。

二、常用的RNA酶抑制剂

1、焦磷酸二乙酯(DEPC):是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性,从而抑制酶的活性。

2、异硫氰酸胍:目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂,它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来,又对RNA酶有强烈的变性作用。

3、氧钒核糖核苷复合物:由氧化钒离子和核苷形成的复合物,它和RNA酶结合形成过渡态类物质,几乎能完全抑制RNA酶的活性。

4、RNA酶的蛋白抑制剂(RNasin):从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂,可以和多种RNA酶结合,使其失活。

5、其它:SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。

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