环介导等温扩增技术(LAMP)原理及引物设计

摘 要:

环介导等温扩增技术(LAMP)是Notomi等于2000年开发的一种恒温核酸扩增方法。其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物,利用链置换DNA聚合酶在等温条件(65℃左右)保温几十分钟,即可完成核酸扩增反应。LAMP 是一种崭新的DNA扩增方法,具有简单、快速、特异性强的特点,具有替代PCR方法的可能性。

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环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是Notomi等于2000年开发的一种恒温核酸扩增方法。其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物,利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在等温条件(65℃左右)保温几十分钟,即可完成核酸扩增反应。不需要模板的热变性、长时间温度循环、繁琐的电泳、紫外观察等过程。LAMP 是一种崭新的DNA扩增方法,具有简单、快速、特异性强的特点,具有替代PCR方法的可能性。

LAMPPCR
温 度反应全程恒温必须要有热循环
时 间约15~60分钟2~3小时
产 物 量约10^10倍 (100亿倍)约10^7倍 (1千万倍)
特 异 性极高,6区域 4 引物2区域 2 引物
检 测无需其他检测步骤,根据扩增反应发生与否判断需其他检测步骤,如电泳
试 剂无需特殊试剂无需特殊试剂

一、环介导等温扩增技术(LAMP)的原理

60-65℃是双链DNA复性及延伸的中间温度,DNA在65℃左右处于动态平衡状态。因此,DNA在此温度下合成是可能的。利用4种特异引物依靠一种高活性链置换DNA聚合酶。使得链置换DNA合成在不停地自我循环。扩增分两个阶段。

第1阶段为起始阶段,任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时,另一条链就会解离,变成单链。上游内部引物FIP的F2序列首先与模板F2c结合,在链置换型DNA聚合酶的作用下向前延伸启动链置换合成。外部引物F3与模板F3c结合并延伸,置换出完整的FIP连接的互补单链。FIP上的F1c与此单链上的Fl为互补结构。自我碱基配对形成环状结构。以此链为模板。下游引物BIP与B3先后启动类似于FIP和F3的合成,形成哑铃状结构的单链。迅速以3' 末端的Fl区段为起点。以自身为模板,进行DNA合成延伸形成茎环状结构。该结构是LAMP基因扩增循环的起始结构。

第2阶段是扩增循环阶段。以茎环状结构为模板,FIP与茎环的F2c区结合。开始链置换合成,解离出的单链核酸上也会形成环状结构。迅速以3’末端的B1区段为起点,以自身为模板。进行DNA合成延伸及链置换.形成长短不一的2条新茎环状结构的DNA,BIP引物上的B2与其杂交。启动新一轮扩增。且产物DNA长度增加一倍。在反应体系中添加2条环状引物LF和LB,它们也分别与茎环状结构结合启动链置换合成,周而复始。扩增的最后产物是具有不同个数茎环结构、不同长度DNA的混合物。且产物DNA为扩增靶序列的交替反向重复序列。

二、LAMP引物的设计

LAMP引物的设计主要是针对靶基因的六个不同的区域,基于靶基因3' 端的F3c、F2c和Flc区以及5' 端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点设计4种引物。

FIP(Forward Inner Primer):上游内部引物,由F2区和F1C区域组成,F2区与靶基因3’端的F2c区域互补,F1C区与靶基因5' 端的Flc区域序列相同。

F3引物:上游外部引物(Forward Outer Primer),由F3区组成,并与靶基因的F3c区域互补。

BIP引物:下游内部引物(Backward Inner Primer ),由B1C和B2区域组成,B2区与靶基因3' 端的B2c区域互补,B1C域与靶基因5' 端的Blc区域序列相同.

B3引物:下游外部引物(Backward Outer Primer ),由B3区域组成,和靶基因的B3c区域互补。

三、LAMP的特点

LAMP与以往的核酸扩增方法相比具有如下优点:

1、操作简单,LAMP核酸扩增是在等温条件下进行,甚至只需要水浴锅即可,产物检测用肉眼观察或浊度仪检测沉淀浊度即可判断。对于RNA的扩增只需要在反应体系中加入逆转录酶就可同步进行(RT.LAMP),不需要特殊的试剂及仪器。

2、快速高效,因为不需要预先的双链DNA热变性.避免了温度循环而造成的时间损失。核酸扩增在l h内均可完成,添加环状引物后时间可以节省1/2。且产物可以扩增至109倍,达0.5 mg/mL。

3、高特异性,由于是针对靶序列6个区域设计的4种特异性引物。6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增。故其特异性极高。

4、高灵敏度,对于病毒扩增模板可达几个拷贝,比PCR高出数量级的差异。

缺点:由于LAMP扩增是链置换合成,靶序列长度最好在300 bp以内。>500 bp则较难扩增。故不能进行长链DNA的扩增。由于灵敏度高。极易受到污染而产生假阳性结果。故要特别注意严谨操作,以及在产物的回收鉴定、克隆、单链分离方面均逊色于传统的PCR方法。

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