聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)的原理及应用

摘 要:

聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)是聚合酶链式反应和变性梯度凝胶电泳结合的方法,能够将有单个碱基差异的DNA分子分离开,已被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域,如分析微生物群落结构、研究功能基因及功能菌群的多样性、检测单个细菌基因的微异质性等。

关键词:

聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳(Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,PCR-DGGE)是聚合酶链式反应和变性梯度凝胶电泳相结合的方法,最初是Lerman 等于20世纪80年代初期发明的,起初主要用来检测DNA片段中的点突变。Muyzer等在1993年首次将其应用于微生物群落结构研究。目前,该技术被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域,目前已经发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一。

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PCR-DGGE能够将具有相同长度但有单个碱基差异的DNA分子分离开。分离以DNA在溶液中的解链特性,当温度或变性剂浓度增高时,DNA分子在不同的区域相对应的解链温度为基础。解链区域的长度从25个碱基对到数百个碱基对不等,与每一个解链区域相对应的解链温度称为解链温度(Tm)。由于一个DNA链上相邻碱基间的堆积作用在DNA双螺旋的稳定上起着相当重要的作用,因此解链区域的Tm值主要取决于核苷酸的序列。既使是很小的变化也会引起DNA片段Tm值的改变,如单碱基替代可引起1.5 ℃的差异。在DGGE系统中,DNA片段在变性剂梯度聚丙烯酰胺凝胶中电泳,凝胶中自上而下所含变性剂浓度呈线性增加。DNA片段在进入变性剂某一浓度时,此浓度下DNA片段在最低温度解链区域解链(相当于该区域的Tm值),此时DNA分子成分枝状结构,它使DNA分子在胶中的移动减慢。如果梯度条件选择恰当,因单个碱基变化使不同的DNA片段在凝胶中的不同位置分叉,随后DNA片段移动减慢,从而使不同DNA片段被分离开来。

PCR-DGGE中常用的变性剂是尿素和甲酰胺。

PCR-DGGE的应用:

1、分析微生物群落结构组成。可用于各种微生物生态系统,包括土壤、活性污泥、人体和动物肠道、温泉、植物根系、海洋湖泊、油藏等。使用PCR方法扩增特定环境样品中混合细菌16S rDNA,通过变性梯度凝胶电泳分析环境样品中的细菌群落结构;将凝胶电泳条带回收后克隆测序,确定细菌种属关系,获得特定样品中的细菌多样性信息。也可用真菌的通用引物扩增18S rRNA基因。

2、通过扩增功能基因来研究功能基因及功能菌群的多样性。

3、跟踪监测细菌的富集和分离,从而评价不同培养基及培养条件对分离菌种的影响。

4、可以检测单个纯菌rRNA基因的微异质性。

5、可以用来比较不同的DNA提取方法。

6、检测PCR和克隆过程中的偏差。

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