Tricine-SDS-PAGE电泳检测分离超低分子量蛋白的方法

摘 要:

聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 是检测分离蛋白质的常用方法,但常规的Tris-甘氨酸-盐酸系统中电泳分离分子量小于10kDa的多肽效果会较差。利用改进的Tricine-SDS-PAGE方法,调整分离胶中聚丙烯酰胺凝胶的分子组成,使致密胶中丙烯酰胺和双丙烯酰胺的交联度为5%,并加入36.5%的尿素,可以有效分离分子量小至1kDa的小肽,明显优于其它方法。

关键词: ,

聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 是检测分离蛋白质的常用方法,使用均匀浓度的SDS-PAGE 来分析分子量在15-200kDa的蛋白质时,电泳迁移率与分子量的对数成线性关系。但常规的Tris-甘氨酸-盐酸系统中电泳分离分子量小于10kDa的多肽效果会较差。

Schagger等曾报道了分离小分子肽的三羟甲基氨基甘氨酸(Tricine)-SDS-PAGE方法(参考文献:Schagger H, von Jagow G. Tricine-sodium dodecyl sulfatepolyacrylamid gel electroporesis for the separation of proteins in the range from 1 to 100kDa. Analytical Biochemistry,1987,166:368-379),利用16.5%凝胶浓度、11%甘油,按“小孔胶+夹层胶+浓缩胶”模式制作不连续梯度胶方法可分离分子量在1~100kDa的蛋白质。但在分离小分子肽的实验中发现该方法分离大于2kDa的蛋白质效果尚可,但分离小至1kDa的小分子时效果并不理想,表现为带型弥散。

2004年,曹佐武等对该方法进进行了改进(参考文献:曹佐武. 有效分离1kDa小肽的Tricine-SDS-PAGE方法. 中国生物工程杂志, 2004,24(1):74-76),发展了一种效果比较理想的分离小至1kDa 的小肽的方法。通过调整分离胶中聚丙烯酰胺凝胶的分子组成,使致密胶中丙烯酰胺和双丙烯酰胺的交联度为5%,并加入36.5%的尿素,用于分离小至1kDa的小分子肽,并与常规的SDS-PAGE和先前报道的Tricine-SDS-PAGE相比较。结果改进的致密胶可以有效分离分子量小至1kDa的小肽,明显优于前面两种方法。

不过,虽然Tricine-SDS-PAGE电泳可以用来分离小肽段的蛋白,但其实验方法比常规SDS-PAGE麻烦一些,条件也不容易掌握,其具体方法如下:

Tricine-SDS-PAGE电泳

组分分离胶间隙胶成层胶
48% Arc-Bis (ml) 3.31.250.3
肽类分离缓冲液 (ml) 3.32.00.93
Urea ( g)3.6--
H2O (ml)3.4 2.751.27
10% AP (ul)503025
TEMED (ul)5.03.02.5
灌胶高度3.621.5

肽类分离缓冲液的配制

1、48%Arc-Bis(32:1):48.02g Arc、1.48g Bis 溶于100ml水;

2、3mol/L Tris-base、PH 8.45 0.3%SDS:36.342g Tris、0.3g SDS溶于80ml水,加入1M HCL调PH值至8.45,定容到100ml;

3、80%甘油;

4、10%AP:0.5g AP溶于5ml水中;

5、Tricine-SDS-PAGE电泳缓冲液:(1)CATION(阳级):200mmol/L,PH8.9 Tris-HCL;(2)阴级:100mmol/L Tris,100mmol/L Tricine,0.5g SDS溶于400ml水中,调PH值至8.25,定容至500 ml;

6、Loading buffer:3 mol/L Tris-base,PH8.45:2.4ml甘油、0.8g SDS、0.1%考马斯蓝G 1.5ML、0.1%酚红0.5ml、2.6ml水混合,用前加DTT,使终浓度为0.3mol/l;

7、49.5% Arc-Bis:46.5g Arc、3.0g Bis溶于100ml水。

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